Proteínas quiméricas de toxoide de Shiga.

Proteína quimérica que comprende:

(i) al menos un polipéptido StxA2,

que es la subunidad A de una toxina Stx2, con una sustitución en cada posición que corresponde a los residuos nativos tirosina 77, ácido glutámico 167 y arginina 170 del polipéptido StxA2 de SEC ID nº: 2, donde dichas sustituciones reducen o eliminan la actividad enzimática del polipéptido StxA2, y

(ii) al menos un polipéptido StxB1 nativo, que es la subunidad B de una toxina Stx1.

Proteínas quiméricas de toxoide de Shiga Campo de la invención

[1] La presente invención se refiere a un toxoide de Shiga quimérico, que se puede usar para vacunar contra las toxinas de Shiga.

Reconocimiento del apoyo federal

[2] Esta presente invención surgió en parte a partir de la investigación financiada por la subvención federal NIH AI2148- 23.

Antecedentes de la invención

[3] En Estados Unidos, Escherichia coli que produce toxina de Shiga (Stx) (STEC) es la causa más común de diarrea con sangre infecciosa (Rangel et al. (25) Emerg. Infect. Dis. 11, 63-9) y registra aproximadamente 11. infecciones por año (Mead et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5, 67-25). La mayoría de las enfermedades mediadas por Stx son atribuibles a un subconjunto de STEC, el E. coli enterohemorrágico, que incluye el serotipo prototípico 157:H7. El síndrome urémico hemolítico (HUS) es una secuela seria de STEC (particularmente la infección 157:H7 que se caracteriza por anemia hemolítica, trombocitopenia trómbica e insuficiencia renal, especialmente entre los pacientes más vulnerables, niños y ancianos. El índice de fatalidad en los que sufren HUS es de cinco a diez por ciento, con potencial para daño de riñón y neurológico residual entre los supervivientes. La terapia para infecciones por STEC incluye cuidado de apoyo, rehidratación y diálisis de riñón (Andreoli et al. (22) Pediatr. Nephrol. 17, 293-8; Klein et al. (22) J. Pediatr. 141, 172-7; y Tarr et al. (25) Lancet 365(9464), 173-86). Actualmente no existe ninguna terapia intervencional o vacuna. Además, el tratamiento antibiótico está contraindicado debido al riesgo aumentado de HUS (Wong et al. (2) N. Engl. J. Med. 342, 193-6) que puede ser provocado por inducción del ciclo lítico de los fagos de conversión de toxina que codifican Stxs en el E. coli.

[4] Hay dos tipos principales de Stxs. Los elementos del primer tipo, Stx producida por S. disenteriae tipo 1 y Stx1 producida por E. coli, son prácticamente idénticos. El segundo tipo, Stx2 es también codificado por E. coli, no obstante, no se realiza la neutralización cruzada por antisueros policlonales contra Stx1, o viceversa (O'Brien et al. (1984) Science 226(4675), 694-6). Variantes de cada serogrupo de Stx existen (por ejemplo, Stxlc, Stxld, Stx2c, Stx2d, Stx2d- activatable, Stx2e, Stx2f) (Melton-Celsa et al. (25) EcoSal-Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, ASM Press, Chapter 8.7.8) pero permanecen neutralizables por sueros policlonales a la toxina prototipo (Schmitt et al. (1991) Infect Immun 59, 165-73; Lindgren et al. (1994) Infect. Immun. 62, 623-31). Stxs son holotoxinas complejas con una composición AB5. Tienen una subunidad enzimáticamente activa (A) y un dominio de unión (B) compuesto por cinco proteínas B idénticas de aproximadamente 7,7 kDa cada una que forman un pentámero. La subunidad A es una proteína de ~32 kDa, es decir asimétricamente dividida por tripsina o furina en la subunidad A1 (aproximadamente 27 kDa) y el péptido A2 (aproximadamente 5 kDa) que permanecen asociados a través de un enlace bisulfuro. Las subunidades A y B maduras de Stx1 y Stx2 tienen 55 % y 61 % de identidad y 68 % y 73 % de similitud, respectivamente. A pesar de las diferencias de secuencia de los aminoácidos, las estructuras de cristal de la holotoxinas son notablemente similares (Fraser et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1, 59-64; Fraser et al. (24) J. Biol. Chem. 279, 27511- 7) y las toxinas tienen el mismo modo de acción. La subunidad A1 contiene la región enzimáticamente activa, una N-glicosidasa que retira un residuo de adenosina del ARNr 28S del ribosoma 6S. Esta alteración detiene la síntesis de proteína y mata la célula intoxicada. El péptido A2 atraviesa el pentámero B para fijar la holotoxina de manera no covalente. El pentámero B se enlaza con la ceramida de globotriaosil del receptor eucariota (Gb3) o Gb4, como es el caso para Stx2e.

[5] Esfuerzos para desarrollar vacunas que protejan contra ambos tipos de Stx han fracasado hasta ahora. Las Stxs son extremadamente potentes y la inactivación de la actividad enzimática es necesaria para utilizar la holotoxinas como vacunas. Una alternativa es usar las subunidades B para suscitar anticuerpos que bloqueen la unión del pentámero B con el receptor celular GB3. Este método ha tenido éxito con StxB1 para elevar la protección contra la inoculación de Stx1, pero la inmunización con la subunidad StxB2 es inefectiva para proteger contra Stx2. Además, la inmunización pasiva de ratones con anticuerpo monoclonal anti-StxA2 protege a los ratones de los efectos de infección con cepas productoras de Stx2 mientras que el anticuerpo monoclonal anti-StxB1 no protege contra tal inoculación (Wadolkowski ef al. (199) Infect. Immun. 58, 2438-45; Lindgren et al. (1993) Infect. Immun. 61, 3832-42). No obstante, los ratones inyectados con una dosis por otro lado letal de Stx1 o Stx2 están protegidos por inmunización pasiva con anti-StxB1 o anti-StxA2, respectivamente. La toxicidad de las subunidades StxA se suprime en gran medida sin el dominio de unión al pentámero B y existen pruebas de que las vacunas compuestas por StxA1 y StxA2 ofrecen protección para toxina homologa en conejos (Bielaszewska et al. (1997) Infect. Immun. 65, 259-16). No obstante, por seguridad, la inactivación de la actividad enzimática sería necesaria para su uso para una vacuna de subunidad A en seres humanos. Las vacunas de subunidad en general son menos deseables desde la perspectiva de que la holotoxina es posible que proporcione un espectro más amplio de anticuerpos protectores que una vacuna de subunidad.

[6] La protección contra las enfermedades mediadas por toxina por inmunización con vacunas de toxoide (holotoxina inactivada) funciona para el tétanos y la difteria. Desafortunadamente, la inactivación química de Stxs con formaldehído o gluteraldehído es un procedimiento químico mal definido que puede provocar toxicidad residual (Metz et al. (23) Vaccine 22, 156-67; Gordon et al. (1992) Infect. Immun. 6, 485- 9) o distorsión potencial de la estructura de la holotoxina nativa de manera que los anticuerpos de neutralización no sean generados o sean de graduación baja. Algunos informes de la bibliografía sugieren que la neutralización cruzada se ha conseguido en animales vacunados con toxoides de Shiga químicamente preparados (Bielaszewska et al. (1997) Infect. Immun. 65, 259-16; Ludwig et al. (22) Can. J. Microbiol. 48, 99-13); no obstante, el potencial para toxicidad que amenace la vida de tal vacuna excluye el uso de toxoides Stx químicos en seres humanos. Una alternativa más segura para los toxoides de Stx químicamente derivados es la construcción de toxoides genéticos a través de la introducción de mutaciones específicas en los genes de la subunidad A de Stx para cambiar los aminoácidos clave del dominio enzimáticamente activo. Toxinas Stx1 y Stx2 híbridas se han creado para estudios funcionales de Stxs (Head et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 3617-3621; Weinstein et al. (1989) Infect. Immun. 57, 3743-5; Melton-Celsa et al. (22) Molecular Microbiology 43, 27-215), incluyendo fusiones de operón que permiten la expresión de la subunidad A y B como un único operón (Weinstein et al., supra). Toxoides genéticos de Stx1 o Stx2 que protegen a los animales de inoculaciones letales posteriores de Stx1 o Stx2 se han realizado previamente (Gordon etal. (1992) Infect. Immun. 6, 485-9; Ishikawa et al. (23) Infect. Immun. 71, 3235-9; Wen etal. (26) Vaccine 24, 1142-8). No obstante, tales toxoides genéticos son incapaces de eludir la falta de neutralización cruzada entre los serogrupos Stx1 y Stx2 y solo proteger contra el grupo de Stx a partir del cual se hicieron. Hasta la fecha, no se ha informado en la bibliografía de la generación de toxoides híbridos de Stx.

Resumen de la invención

[7] La invención abarca una proteína quimérica que comprende al menos un polipéptido de StxA con una o más modificaciones en uno o más sitios activos tal y como se define en la reivindicación 1, y al menos un polipéptido de StxB. En algunos aspectos que aquí se describen, la proteína quimérica existe como un pentámero. En otros aspectos, el polipéptido de StxB o fragmento del mismo comprende una o más modificaciones donde la o las modificaciones son una sustitución, adición y/o deleción de aminoácidos. En algunos aspectos, la sustitución es una sustitución de aminoácidos conservadora. En otros aspectos, el polipéptido de StxA es StxA2 o un fragmento del mismo y/o el polipéptido de StxB es StxB1 o un fragmento del mismo. En otro aspecto, la proteína comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n°: 2 y/o 3. Las proteínas quiméricas de la invención comprenden una sustitución en cada residuo de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Proteína quimérica que comprende:

(i) al menos un polipéptido StxA2, que es la subunidad A de una toxina Stx2, con una sustitución en cada posición que corresponde a los residuos nativos tirosina 77, ácido glutámico 167 y arginina 17 del polipéptido StxA2 de SEC ID n°: 2, donde dichas sustituciones reducen o eliminan la actividad enzimática del polipéptido StxA2, y

(ii) al menos un polipéptido StxB1 nativo, que es la subunidad B de una toxina Stx1.

2. Composición que comprende la proteína quimérica según la reivindicación 1.

3. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína quimérica según la reivindicación 1.

4. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3.

5. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 4.

6. Método para producir un polipéptido que comprende el cultivo de una célula huésped transformada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 bajo condiciones en las que la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es expresada.

7. Proteína quimérica según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 2 para su uso como un medicamento.

8. Uso de una proteína quimérica según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 2 para la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la diarrea y/o el síndrome urémico hemolítico en un mamífero.

9. Proteína quimérica según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento o la prevención de la diarrea y/o el síndrome urémico hemolítico en un mamífero.

1. Uso según la reivindicación 8 o una proteína quimérica para su uso según la reivindicación 9, donde la diarrea es diarrea asociada a una infección de Escherichia coli que produce la toxina de Shiga.

11. Uso o proteína quimérica para su uso o composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1, donde el mamífero es un humano.

12. Proteína quimérica según la reivindicación 1, donde la sustitución en el residuo 77 del polipéptido StxA2 es una sustitución Y77S.

13. Proteína quimérica según la reivindicación 1, donde la sustitución en el residuo 167 del polipéptido StxA2 es una sustitución E167Q.

14. Proteína quimérica según la reivindicación 1, donde la sustitución en el residuo 17 del polipéptido StxA2 es una sustitución R17L.

15. Proteína quimérica según la reivindicación 1, donde la sustitución en el residuo 77 del polipéptido StxA2 es una sustitución Y77S, la sustitución en el residuo 167 del polipéptido StxA2 es una sustitución E167Q y la sustitución en el residuo 17 del polipéptido StxA2 es una sustitución R17L.