Anticuerpos monoclonales de ERG.

Un anticuerpo monoclonal que se une con un epítopo formado por los aminoácidos 42-66 de SEC ID Nº: 1.

Anticuerpos monoclonales de ERG

Declaración del interés del gobierno La presente invención se realizó parcialmente con apoyo del gobierno de los Estados Unidos a partir de investigación financiada por el número de contrato HU0001-04-C-1502 de la Universidad de Ciencias de la Salud de los Servicios Uniformados y la subvención W81XWH-08-1-0532 de la Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad y se basa en la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos 61/173.834 presentada el 29 de abril de 2009.

Antecedentes El proto-oncogén del gen relacionado con ETS (ERG) se sobreexpresa en el 60-70 % de los tumores de próstata como resultado de fusiones génicas recurrentes que implican a TMPRSS2 y a la familia ETS de genes (Petrovics et al., 2005; Tomlins et al., 2005; revisado en Kumar-Sinha et al., 2008) . Estudios emergentes sobre muestras de ensayo de cánceres de próstata humana y diversos modelos experimentales subrayan la función oncogénica causativa de ERG en cáncer de próstata (Klezovitch et al., 2008; Tomlins et al., 2008; Sun et al., 2008; Wang et al., 2008) . Numerosos informes destacan las características tanto de diagnóstico como de pronóstico de la actividad genómica de ERG revelando que aproximadamente la mitad de los tumores de próstata albergan la fusión génica más común que tiene lugar entre el promotor del gen TMPRSS2 regulado por receptor de andrógenos y la secuencia codificante de la proteína ERG (revisado en Kumar-Sinha et al., 2008) . La fusión entre el promotor del gen TMPRSS2 y ERG da como resultado la sobreexpresión de formas truncadas en el extremo N terminal o de longitud completa de ERG (Klezovitch et al., 2008; Sun et al., 2008) . También se han identificado en cáncer de próstata acontecimientos de fusión entre erg y otras secuencias promotoras inducibles por andrógenos, tales como SLC45A3 (Han et al., 2008) y NDRG1 (Pflueger et al., 2009) .

Se ha destacado el mal resultado de enfermedad para pacientes con tumores que albergan duplicaciones de fusiones MPRSS2/ERG o pérdidas cromosómicas (Edel) asociadas con el acontecimiento de fusión (Attard et al., 2008; FitzGerald et al., 2008; Mehra et al., 2008) . El diagnóstico actual de cáncer de próstata se basa en diversas características histológicas, incluyendo patrón de crecimiento arquitectónico, pérdida de células basales, atipia nuclear, citoplasma anfifílico, mucina azul intraluminal, secreción amoría rosa y figuras mitóticas (Egevad, 2008) . Si algunas de estas características no resultan evidentes, puede ser difícil para los patólogos diagnosticar el cáncer de próstata, especialmente en el caso de biopsias de aguja de próstata con contenido tumoral muy limitado (Mostofi et al., 1992; Mostofi et al., 1993) . Se usan en la actualidad marcadores moleculares para ayudar al diagnóstico. Por ejemplo, el diagnóstico de cáncer de próstata puede incluir tinción de células basales de glándulas benignas para citoqueratina específica o p63 (CK903, p63) y alfa-metil-acil-CoA-Racemasa asociada con células tumorales (AMACR o P504S) (Luo et al., 2002; Rubin et al., 2002) . Sin embargo, estos marcadores moleculares tienen limitaciones notables en el diagnóstico rutinario. Se encuentra expresión de AMACR en otras diversas lesiones no malignas, incluyendo hasta el 21 % de glándulas prostáticas benignas, 58 % de adenomas nefrogénicos y aproximadamente el 18 % de casos de hiperplasia adenomatosa atípica (Beach et al., 2002; Gupta et al., 2004; Jiang et al., 2001; Yang et al., 2002) . Nuevos datos que evalúan la sobreexpresión de ERG y el reordenamiento genómico de TMPRSS2/ERG, están proporcionando nuevas estrategias altamente prometedoras en diagnóstico y pronóstico de cáncer de próstata (Furusato et al., 2008; Saramaki et al., 2008) .

Se han descrito fusiones de EWS-ERG en un subconjunto pequeño de sarcoma de Ewing, mientras que se ha destacado la sobreexpresión de ERG sin fusión en leucemia mieloide aguda y leucemia linfoblástica T aguda (Marcucci et al., 2005; Baldus et al., 2006) . También se ha ligado la sobreexpresión de ERG a la leucemia megacarioblástica (Rainis et el. 2005) . Otros estudios sugieren que el aumento de la expresión de ERG desempeña un papel en la Enfermedad de Alzheimer (AD) y neuropatía de tipo AD en Síndrome de Down (Shim et al., 2003; Ng et al. 2010) .

La estructura del gen ERG humano incluye al menos 17 exones que abarcan aproximadamente 300 kilobases de secuencia genómica y que generan al menos nueve transcritos separados (Owczarek et al., 2004) . Las isoformas ERG1-ERG5 codifican cinco polipéptidos separados que pueden unirse con el sitio ETS y actuar como activadores transcripcionales (Owczarek et al., 2004) . De estas cinco isoformas, ERG3 es la más larga, codificando un polipéptido de 479 aminoácidos (SEC ID Nº : 1; Nº de referencia NP_891548-1) . Las isoformas ERG6-ERG9 representan formas de corte y empalme alternativo con un exón 5’ diferente de otras isoformas de ERG. Aunque ERG7 y ERG8 tienen fases abiertas de lectura, ERG6 codifica múltiples codones de parada, lo que sugiere que este transcrito ERG no codifica una proteína funcional (Owczarek et al., 2004) . El transcrito de ERG9 no contiene un

codón de inicio potencial o una señal de poliadenilación consenso lo que sugiere que podría ser también un transcrito no codificante (Owczarek et al., 2004) .

Aunque el proto-oncogén ERG se caracterizó inicialmente hace más de veinte años (Rao et al., 1987a; Rao et al., 1987b; Reddy et al., 1987) , en la actualidad no hay ningún anticuerpo disponible para detectar ERG en muestras de ensayo clínicas. La proteína ERG pertenece a un grupo altamente homólogo de proteínas, la familia multigénica ETS (específica de E-veintiséis, específica de transformación de E26) de factores de transcripción, que están conservadas en todos los metazoos (Turner y Watson, 2008) . Las proteínas de ETS contienen un dominio de unión a ADN hélice-vuelta-hélice alado y un dominio puntiagudo (SAM) implicado en la interacción proteína-proteína. El alto grado de homología entre miembros de esta familia presenta un obstáculo significativo para inducir un anticuerpo contra un miembro específico de esta familia de proteínas. Se han inducido anticuerpos policlonales contra ERG-2 expresado en bacterias en Murakami et al. y se han descrito anticuerpos contra proteínas de fusión de ERG en el documento WO 2007/033187.

Sin embargo, aunque están disponibles en el mercado anticuerpos de ERG policlonales, estos anticuerpos muestran baja afinidad por niveles endógenos de la proteína ERG y altos niveles de tinción no específica que limita su utilidad, por ejemplo, en ensayos de inmunohistoquímica. Como tales, los anticuerpos de ERG policlonales disponibles en el mercado no son adecuados para detectar proteínas ERG en situaciones clínicas (por ejemplo, en una biopsia tisular) .

Sumario La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen con ERG humano y pueden usarse, por ejemplo, en métodos para detectar y tratar cánceres asociados con acontecimientos de fusión de ERG y/o sobreexpresión de ERG, tales como cáncer de próstata. Los anticuerpos muestran alta afinidad por ERG humano con de poca a ninguna tinción específica y por lo tanto son adecuados para detectar proteínas ERG en situaciones clínicas, incluyendo biopsias tisulares, sangre y orina.

Una realización se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une con ERG humano y, más específicamente, a un epítopo formado por la siguiente secuencia polipeptídica: GQTSKMSPRVPQQDWLSQPPARVTI, que corresponde a los restos de aminoácidos 42-66 de ERG3 humano (SEC ID Nº : 1) y se denomina en lo sucesivo en el presente documento el “epítopo ERG 42-66”. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une con ERG humano, en el que la unión del anticuerpo con ERG3 humano (SEC ID Nº 1) se inhibe de forma competitiva por un polipéptido que corresponde a los restos de aminoácidos 42-66 de ERG3 humano.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por el clon de hibridoma 9FY (“anticuerpo 9FY”) . En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une con el epítopo ERG 42-66 e inhibe de forma competitiva la unión del anticuerpo 9FY con ERG3 humano.

En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal es humanizado, quimerizado o completamente humano. En un aspecto, el anticuerpo monoclonal comprende las regiones determinantes... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que se une con un epítopo formado por los aminoácido.

4. 66 de SEC ID Nº : 1.

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) en SEC ID Nº : 2 y un dominio variable de cadena pesada que comprende las tres CDR en SEC ID Nº : 3.

3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2, en el que el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 y el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 3.

4. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho anticuerpo compite con un polipéptido que consiste en los aminoácido.

4. 66 por la unión con un polipéptido que tiene la secuencia de 15 aminoácidos de SEC ID Nº : 1.

5. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho anticuerpo inhibe de forma competitiva la unión de un anticuerpo que tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 2 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 3 con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 1.

6. Un método para detectar ERG humano o una proteína de fusión que comprende todo o una parte de un polipéptido de ERG humano en una muestra biológica, en donde el método comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 con la muestra biológica y analizar la muestra biológica para detectar la unión del anticuerpo monoclonal con ERG humano o la proteína de fusión que comprende todo o parte del polipéptido de ERG humano en la muestra biológica.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la muestra biológica comprende un tejido o una célula.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el tejido o la célula es un tejido de próstata o una célula de próstata.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que la proteína de fusión es una proteína ERG codificada por un transcrito de fusión TMPRSS2/ERG.

10. Un método para generar un anticuerpo monoclonal que se une con el epítopo ER.

4. 66, que comprende administrar una composición que comprende un polipéptido que no tiene más de 60 restos de aminoácidos, en el que el polipéptido incluye los restos de aminoácido.

4. 66 de SEC ID Nº : 1, a un mamífero no humano, aislar linfocitos B del mamífero no humano, inmortalizar los linfocitos B para crear una línea celular capaz de producir un anticuerpo monoclonal y seleccionar el anticuerpo monoclonal que se une con el epítopo ER.

4. 66.

11. Un método para identificar una molécula de ácido nucleico o un polipéptido que interaccionan con un polipéptido de ERG, que comprende incubar una muestra que comprende la molécula de ácido nucleico o el polipéptido con el polipéptido de ERG, incubar la muestra y el polipéptido de ERG con el anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y determinar si se forma un complejo entre la molécula de ácido nucleico y el polipéptido de 45 ERG o entre el polipéptido y el polipéptido de ERG, en donde la detección de la formación de un complejo con el anticuerpo indica que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido interaccionan con el polipéptido de ERG.