Método para el diagnóstico de Trombocitemia esencial y kit para realizarlo.

Método para el diagnóstico de Trombocitemia esencial y kit para realizarlo.

La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente de la Trombocitemia esencial JAK2WT, el cual comprende la cuantificación de SERPINB1 mediante inmunohistoquímica, preferiblemente en granulocitos de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea. El método adicionalmente puede comprender la cuantificación de CD44. La presente invención también se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente Trombocitemia Esencial JAK2WT.

La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente de la Trombocitemia esencial JAK2 Wild Type, el cual comprende la cuantificación de SERPINB1 de forma independiente o en combinación con CD44, preferiblemente en granulocitos de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea. La presente invención también se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas y más concretamente Trombocitemia esencial JAK2WT que permite realizar el método indicado. Por tanto la presente invención podría encuadrarse en el campo de la biotecnología y más concretamente en la biomedicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las neoplasias mieloproliferativas (NMPs) son trastornos hematológicos crónicos. Este término engloba un conjunto de trastornos los cuales presentan como característica común la hiperproducción de al menos una línea de células sanguíneas. De forma general estos trastornos cursan con hiperplasia eritroide y/o megacariocítica.

Dentro de estas enfermedades, se encuentra la Trombocitemia Esencial (TE), la cual se debe a una superproducción de células sanguíneas, especialmente de plaquetas en la médula ósea. Esta superproducción provoca la formación de trombos y bloqueos en los vasos sanguíneos, así como episodios hemorrágicos.

De forma general esta neoplasia mieloproliferativa, ha sido tradicionalmente diagnosticada por exclusión, cuando se manifiesta la ausencia de condiciones reactivas y desordenes clónales que se pueden presentar en la trombocitosis (Beer et al. 2011, Blood, 117:1472-1482). Aproximadamente el 50% de los casos de TE presentan una mutación en el gen jak2 (Janus quinasa 2) que provoca la sustitución de una valina por una fenilalanina en la posición 617 de la proteína resultante (JAK2 V617F (Campbell et al. 2006, N Engl. J Med, 255:2452-2466; Levine et al. 2007, Nat Rev Cáncer, 7:673-683). Por otro lado, las mutaciones MPL están presentes en el 4%

de los casos (Pikman et al. 2006, PLoS Med, 3:e270; Beer et al. 2008, Blood, 112: 141-149). Sin embargo en pacientes que no tienen esas mutaciones el diagnóstico de TE tiene que hacerse por exclusión de causas reactivas. La diferenciación de TE de Policitemia Vera (PV) y Mielofibrosis Primaria (MFP) es particularmente problemática. Además cabe destacar que muchos pacientes con neoplasias mieloproliferativas, y más concretamente con TE, son asintomáticos, resulta necesaria la búsqueda de elementos que permitan un rápido y sencillo diagnóstico de la enfermedad para por ejemplo individuos de riesgo.

Por otro lado resulta de vital importancia tener un diagnóstico rápido y preciso para poder seleccionar el tratamiento adecuado, ya que este tratamiento depende de diversos criterios de riesgo los cuales a su vez vienen determinados en función del diagnóstico. La neoplasia mieloproliferativa TE JAK2V617F positiva de forma habitual es diagnosticada rápidamente. Sin embargo el diagnóstico de la neoplasia mieloproliferativa Trombocitemia Esencial JAK2 wild type en pacientes conlleva un largo tiempo de espera ya que debido a la falta de criterios diagnósticos y elementos que permitan su diagnóstico rápido se requieren seguimientos de entre 3 y 6 meses para confirmar la existencia de hematopoyesis no reactiva. Este retraso provoca un incremento en el riesgo de sucesos hemorrágicos y trombóticos en pacientes de alto riesgo (Giona et al. 2012, Blood, 119:2219-2227; Martínez-Aviles et al. 2012, Ann Hematol, 91(4):533-541; Ponce et al. 2012, Leuk Res, 36(1):93-97; Teofili et al. 2011, Blood, 117(9):2700-2707; Tefferi etal. 2010, Leukemia, 24:1302-1309).

A pesar de que se han encontrado algunos marcadores moleculares para la Trombocitemia esencial JAK2V617F negativa (o trombocitemia esencial WT), como por ejemplo la mutación MPL, estas no son una herramienta diagnóstica útil ya que presenta una baja prevalencia (<5%). Por tanto sigue resultando necesario encontrar marcadores fiables que permitan el diagnóstico de estas enfermedades. Además el diagnóstico de la TE JAK2WT se basa en criterios de exclusión, no habiendo ningún criterio positivo de la enfermedad. El diagnóstico se basa en la determinación de trombocitosis, y con una médula ósea compatible mediante un estudio anatomo- patológico excluir el resto de causas de causas de trombocitosis. Por estas razones es necesaria la implementación de nuevas pruebas diagnósticas.

El inhibidor B1 de la serín proteasa de la familia SERPINB humana, promueve la movilidad de las células cancerosas (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776) y es expresada por los granulocitos. SERPINB1 es más conocido como serpin peptidase inhibitor, y su función es la de protector ante las endopeptidasas y regulador de numerosas proteasas: Neutrophil proteases elastase, Catepsina G, Proteinasa-3, Quimasa, Quimiotripsina, y Kallikreina-3. Este papel protector le implica en la supervivencia y maduración de los neutrófilos, tanto de sangre periférica como de médula ósea, y especialmente de las series inmaduras de la línea mieloide. También parece jugar un papel protector respecto a la migración y metástasis en algunos fenómenos neoplásicos, (Tseng et al. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776) aunque otros autores han encontrado justo lo contrario, una sobre-expresión de esta proteína en canceres con un alto grado de migración y metástasis (Miyata T et al. 2002, J Clin Invest. 109: 585-93).

CD44 es un receptor del ácido hialurónico expresado en la membrana de los granulocitos y participa en la interacción y migración celular. La proteína CD44 es el receptor del acido hialurónico, y está íntimamente ligado a MMP14, compartiendo función en la remodelación de la matriz extracelular (Tseng etal. 2009, Oral Oncol, 45: 771-776). El receptor del ácido hialurónico es una proteína ubicua en la mayoría de las estirpes celulares. Tiene una estrecha relación con proteínas de citoesqueleto y proteínas relacionadas con la adhesión y la remodelación de la matriz celular como las metalo-proteasas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se describe un método sencillo y preciso de diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas, y más concretamente de Trombocitemia Esencial (TE) JAK2WT (Wild Type). Este método ofrece una alternativa para el proceso de diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas. Además el método presenta como ventaja que permite diagnosticar TE JAK2WT. El método de la presente invención requiere la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 de forma independiente o en combinación con la proteína CD44, mediante inmunohistoquímica, y presenta altos niveles de sensibilidad y especificidad. El método permite que un paciente sea diagnosticado como paciente con neoplasia mieloproliferativa,

diferenciándolos así por ejemplo de pacientes con trombocitosis, enfermedad que presenta una sintomatología similar. Por tanto el método de la invención permite clasificar individuos de forma correcta dentro de una patología para poder administrar un tratamiento adecuado diferenciándolos de individuos con otras enfermedades de sintomatología similar.

Cabe destacar que el método de la invención se lleva a cabo fuera del cuerpo del sujeto en una muestra biológica aislada del mismo.

La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa caracterizado porque comprende la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de un sujeto. La inclusión en el método de la cuantificación del nivel de expresión de la proteína CD44 mediante inmunohistoquímica permitiría diagnosticar neoplasias mieloproliferativas y más concretamente TE JAK2WT con mayor precisión que utilizando de forma independiente SERPINB1. Además el uso de inmunohistoquímica permite también una mayor precisión que otros métodos conocidos para la medición de los niveles de proteínas como por ejemplo western-blot o citoquímica.

Se entiende por inmunohistoquímica en la presente invención un procedimiento histopatológico que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, el cual forma un complejo con el antígeno que reconoce el cual se aplica a una muestra de tejido o fluido biológico. Este anticuerpo específico puede encontrarse previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno, o bien ser reconocido por un segundo anticuerpo el cual es el que se encuentra marcado para hacer visibles los puntos donde el anticuerpo se une al antígeno y por tanto... [Seguir leyendo]

1. Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa caracterizado porque comprende la cuantificación del nivel de expresión de la proteína SERPINB1 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea de un sujeto.

2. Método según la reivindicación 1, en el que además se cuantifica el nivel de expresión de la proteína CD44 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea de un sujeto.

3. Un método para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa de un sujeto que comprende las siguientes etapas:

a. cuantificar el nivel de expresión de la proteína SERPINB1 mediante inmunohistoquímica en una muestra biológica aislada de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea de un sujeto,

b. comparar el valor obtenido en (a) con un valor estándar.

4. Método según la reivindicación 3 que además comprende:

c. asignar al sujeto del paso (a) al grupo de pacientes que padecen una neoplasia mieloproliferativa cuando el valor obtenido en el paso (a) es significativamente mayor que el valor estándar del paso (b).

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 que además comprende la cuantificación del nivel de expresión de CD44.

6. Método según la reivindicación 5 donde la asociación del sujeto al grupo de pacientes que padecen una neoplasia mieloproliferativa se produce cuando el valor obtenido de CD44 es significativamente mayor que el valor estándar.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 donde el valor estándar es el nivel de expresión de la proteína SERPINB1 y/o CD44 en una muestra biológica

aislada de un sujeto sano o una media de los niveles de expresión de la proteína SERPINB1 y/o CD44 en muestras biológicas aisladas de varios pacientes sanos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 donde el valor estándar es el nivel de expresión de la proteína SERPINB1 y/o CD44 en una muestra biológica aislada de médula ósea, coágulo o aspirado de médula ósea de un sujeto que padece una trombocitosis.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la neoplasia mieloproliferativa se selecciona de la lista que comprende Policitemia Vera, Mielofibrosis Primaria, Trombocitemia Esencial JAK2WT o Trombocitemia Esencial JAK2V617F.

10. Método según la reivindicación 9 donde la donde la neoplasia mieloproliferativa es Trombocitemia Esencial JAK2WT.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el anticuerpo primario para SERPINB1 es HPA018871 SERPINB1.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde el sujeto es un humano.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la muestra biológica aislada es médula ósea.

14. Uso de un kit que comprende anticuerpos específicos para SERPINB1 para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa.

15. Uso de un kit según la reivindicación 14 que además comprende anticuerpos específicos para CD44 para el diagnóstico de una neoplasia mieloproliferativa.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 donde la neoplasia mieloproliferativa se selecciona de la lista que comprende Policitemia Vera,

Mielofibrosis Primaria, Trombocitemia Esencial JAK2WT o Trombocitemia Esencial JAK2V617F.

17. Uso según la reivindicación 16 donde la neoplasia mieloproliferativa es 5 Trombocitemia Esencial JAK2WT.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 donde el anticuerpo primario para SERPINB1 esHPA018871 SERPINB1.