Método para discriminar polimorfismos mononucleotídicos (SNP).

Método para genotipado en ensayos de tipado aplicados a una muestra biológica,

conteniendo la muestra un ácido nucleico diana de interés y siendo el ácido nucleico diana susceptible de contener un polimorfismo mononucleotídico (SNP) bialélico, que comprende las etapas de:

- efectuar una amplificación por NSABA o TMA de la diana, generando múltiples copias de amplicones, en presencia de al menos dos sondas marcadas diferentes, siendo cada sonda una baliza molecular que permite la detección instantánea de la posición de SNP tanto del tipo silvestre como de al menos una posible mutación,

- evaluar el valor o valores de la variable discriminatoria basándose en las señales de cada combinación de dos sondas de detección, y

- discriminar entre los genotipos basándose en el valor de la variable discriminatoria,

en el que el valor de la variable discriminatoria para un genotipo heterocigótico es una relación seleccionada del grupo consistente en (kWT→ WT + kWT→ m)/(km→ m + km→ WT), (kWT→ WT - kWT→ m)/( km→ m - km→ WT), ( kWT→ WT X kWT→ m) / (km→ m x km-→ WT), ( kWT-→ WT/kWT→ m)/(km→ m / km→ WT) y sus recíprocos;

el valor de la variable discriminatoria para un genotipo mutante homocigótico es una relación de kWT-m/km-m o su recíproco; y

el valor de la variable discriminatoria para un tipo silvestre homocigótico es una relación de kWT→ WT/km→ WT o su recíproco.

Mïtodo para discriminar polimorfismos mononucleotïdicos (SNP)

La presente invenciïn proporciona un mïtodo para discriminar polimorfismos mononucleotïdicos (SNP) que ofrece una sensibilidad y especificidad mejoradas.

Un polimorfismo mononucleotïdico (SNP) es un cambio de una sola base o mutaciïn puntual, pero incluye tambiïn las denominadas mutaciones “indel” (inserciones o deleciones de un nucleïtido) , que da como resultado la variaciïn genïtica entre individuos. Los SNP, que constituyen aproximadamente un 90 % de toda la variaciïn genïtica humana, aparecen cada 100 a 300 bases a lo largo del genoma humano de 3.000 millones de bases. Sin embargo, los SNP pueden aparecer mucho mïs frecuentemente en otros organismos como virus. Los SNP pueden aparecer en regiones de codificaciïn o de no codificaciïn del genoma. Un SNP en la regiïn de codificaciïn principal puede cambiar o no la secuencia de aminoïcidos de un producto proteico. Un SNP en una regiïn de no codificaciïn puede alterar los sitios promotores o procesadores y puede afectar a la transcripciïn y/o procesamiento gïnicos. El conocimiento de si un individuo tiene SNP particulares en una regiïn genïmica de interïs puede proporcionar suficiente informaciïn para desarrollar aplicaciones de diagnïstico, preventivas y terapïuticas para una variedad de enfermedades.

Existen muchos mïtodos para genotipar SNP. Un requisito clave de un mïtodo de genotipado de SNP es que distinga inequïvocamente entre las variantes alïlicas presentes. Como los seres humanos son diploides, existen tres posibles genotipos para un SNP bialïlico: que el paciente tenga una secuencia de tipo silvestre homocigïtica, una secuencia mutada homocigïtica o la secuencia heterocigïtica. La mayorïa de estos mïtodos pueden separarse en cuatro grupos basados en los mecanismos celulares: hibridaciïn especïfica de alelo, ligamiento de oligonucleïtidos especïfico de alelo, extensiïn de cebador y secuenciaciïn.

Mïs recientemente, la apariciïn de la PCR instantïnea ha permitido el desarrollo de mïtodos homogïneos para la detecciïn de SNP tales como el anïlisis de la curva de fusiïn de sondas de FRET y el ensayo de nucleasa fluorogïnica 5’, tambiïn conocido como el ensayo TaqManï. Estos mïtodos son atractivos porque se logra la amplificaciïn de seïal y la detecciïn alïlica en un solo tubo cerrado. Usan sondas oligonucleotïdicas especïficas de alelo fluorogïnicas (ASO) y se llevan a cabo generalmente en termocicladores instantïneos que comprenden un fluorïmetro integrado. Estos mïtodos requieren un diseïo de sonda asï como una composiciïn de tampïn y ajuste de las condiciones de ciclado por PCR apropiados. Por tanto, en estas condiciones de ciclado, una de las variables mïs importantes para optimizar es la temperatura de asociaciïn (Ta) , que es la temperatura que permite la uniïn de los cebadores a hebras de ADN sencillas. Una Ta baja puede causar la sïntesis de productos de PCR no especïficos, mientras que el uso de una Ta alta puede reducir el rendimiento de un producto de PCR deseado. Por consiguiente, el uso de una Ta ïptima minimiza, pero no evita, la hibridaciïn cruzada del ADN diana con un cebador incluso en presencia de un desapareamiento. La diferencia en eficacia de la amplificaciïn por PCR entre los cebadores puede no ser suficientemente grande para permitir una fïcil discriminaciïn entre el nucleïtido normal y el nucleïtido mutado.

Para mejorar la detecciïn de SNP por PCR instantïnea, se ha optimizado la monitorizaciïn de fluorescencia.

El anïlisis de la curva de fusiïn de sondas de hibridaciïn de FRET es una tecnologïa patentada por la Universidad de Utah (documento WO-A-97/46707) . En su configuraciïn mïs sencilla, la mezcla de reacciïn incluye dos sondas oligonucleotïdicas que hibridan con regiones adyacentes de la secuencia diana. Los extremos 3’ y 5’ adyacentes de las dos sondas se marcan con tintes fluorescentes. La luz fluorescente emitida por el “donante” excita el fluorïforo del “aceptor”, creando un complejo fluorogïnico ïnico. El complejo se forma solo cuando las sondas se unen a sitios adyacentes en ADN amplificado. Una vez se completa la amplificaciïn por PCR, se genera una “curva de fusiïn” mediante calentamiento lento del heterodïplex de amplicïn/sonda y medida de los cambios de fluorescencia resultantes de la disociaciïn de la sonda y el amplicïn. El principio del anïlisis de la curva de fusiïn es que cada ADN bicatenario tiene su propia temperatura de fusiïn (Tm) especïfica, que se define como la temperatura a la que un 50 % del ADN se vuelve monocatenario. Por tanto, la curva de temperatura difiere en los alelos normal y mutante. El desapareamiento mononucleotïdico entre la sonda mutada y el alelo de tipo silvestre causa que la sonda se disocie o funda a una temperatura menor que el complejo formado con el alelo mutante.

Aunque esta tecnologïa puede usarse para identificar SNP en un ïcido nucleico, sufre no obstante algunos inconvenientes en aplicaciones prïcticas. Como las diferencias en las secuencias entre los dos tipos de alelos son muy pequeïas, es muy posible que la sonda diseïada para unirse preferentemente a un tipo de amplicïn muestre tambiïn uniïn al otro tipo de amplicïn. Por ejemplo, en el caso de sustituciïn como SNP, el efecto sobre la cinïtica de fusiïn de los productos de PCR es demasiado pequeïo para detectarse fiablemente.

Una alternativa comïn al enfoque de la curva de fusiïn es usar sondas de hidrïlisis (TaqManï) . Esta tïcnica se da a conocer en la solicitud internacional WO-A-92/02638. El ensayo de exonucleasa 5’ usa inactivaciïn por FRET para analizar el ADN diana amplificado por reacciïn en cadena de la polimerasa (PCR) . Las sondas son oligonucleïtidos que contienen restos fluorïforos e inactivadores localizados preferiblemente en los extremos 5’ y 3’. El enfoque usa dos sondas de ASO marcadas complementarias de los alelos mutante y normal. Las dos sondas contienen

diferentes tintes fluorescentes indicadores, pero comparten un tinte inactivador comïn. Cuando estïn intactas, las sondas no tienen fluorescencia debido a la proximidad de los tintes indicador e inactivador. Durante la fase de asociaciïn de la PCR, las dos sondas compiten por la hibridaciïn a sus secuencias diana en 5’ de los sitios cebadores. La sonda hibridada se escinde posteriormente por la actividad 5’ nucleasa de la polimerasa de Thermophilus aquaticus (Taq) a medida que se extiende el cebador. Esto da como resultado la separaciïn de los tintes indicadores del inactivador, causando aumentos significativos de la emisiïn de fluorescencia. El genotipado se determina mediante la medida de la intensidad de fluorescencia de los dos tintes indicadores despuïs de amplificaciïn por PCR. Puesto que las sondas TaqManï se digieren durante la amplificaciïn por PCR instantïnea, no estïn disponibles sondas para el anïlisis de la curva de fusiïn postamplificaciïn. Explotando esta tecnologïa de ensayo de nucleasa 5’ clïsico, se genera una seïal de fluorescencia independiente de la temperatura durante el proceso de PCR por la degradaciïn por exonucleasa de una sonda TaqMan hibridada.

Este mïtodo necesita un diseïo cuidados de las sondas para permitir la discriminaciïn de las dianas polimïrficas, ya que las sondas perfectamente coincidentes se degradan preferentemente y generan aumentos de la seïal de fluorescencia. Como se afirma anteriormente para el anïlisis de la curva de fusiïn, esta tïcnica genera problemas similares de riesgo de artefactos.

Por tanto, sigue existiendo demanda de mïtodos altamente sensibles que sean ïtiles para determinar SNP en secuencias de ïcido nucleico.

La amplificaciïn instantïnea ha permitido el desarrollo de ensayos cualitativos de genotipado de SNP como se expone anteriormente, pero tambiïn de ensayos cuantitativos para la expresiïn gïnica o medida de la carga vïrica. En estos campos, los datos obtenidos durante la amplificaciïn se usan para determinar la cantidad de ïcido nucleico diana en la muestra original. Han sido necesarios un montïn de estudios para efectuar ensayos cuantitativos y existen varios mïtodos. En el caso del proceso de amplificaciïn NASBA, asociado a la detecciïn de balizas moleculares, se ha descrito un mïtodo para la cuantificaciïn de las cargas vïricas en Nucleic Acids Research, 2002, vol. 30, nï6 e26. Este mïtodo permite determinar la cantidad de ARN de VIH-1 en una muestra original. La evaluaciïn de esta cantidad estï basada en la cinïtica de la fluorescencia generada por la combinaciïn tanto de la velocidad de transcripciïn de NASBA como de la velocidad de asociaciïn de la baliza... [Seguir leyendo]

1. Mïtodo para genotipado en ensayos de tipado aplicados a una muestra biolïgica, conteniendo la muestra un ïcido nucleico diana de interïs y siendo el ïcido nucleico diana susceptible de contener un polimorfismo mononucleotïdico (SNP) bialïlico, que comprende las etapas de:

- efectuar una amplificaciïn por NSABA o TMA de la diana, generando mïltiples copias de amplicones, en presencia de al menos dos sondas marcadas diferentes, siendo cada sonda una baliza molecular que permite la detecciïn instantïnea de la posiciïn de SNP tanto del tipo silvestre como de al menos una posible mutaciïn,

- evaluar el valor o valores de la variable discriminatoria basïndose en las seïales de cada combinaciïn de dos sondas de detecciïn, y

- discriminar entre los genotipos basïndose en el valor de la variable discriminatoria,

en el que el valor de la variable discriminatoria para un genotipo heterocigïtico es una relaciïn seleccionada del grupo consistente en (kWTºWT+ kWTºm) / (kmºm + kmºWT) , (kWTºWT–kWTºm) / ( kmºm –kmºWT) , ( kWTºWTX kWTºm) / (kmºm x km->WT) , ( kWT->WT/kWTºm) / (kmºm/ kmºWT) y sus recïprocos;

el valor de la variable discriminatoria para un genotipo mutante homocigïtico es una relaciïn de kWTºm/kmºm o su recïproco; y

el valor de la variable discriminatoria para un tipo silvestre homocigïtico es una relaciïn de kWTºWT/kmºWT o su recïproco.

2. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, en el que la amplificaciïn se efectïa poniendo en contacto la muestra con un par de cebadores, estando los cebadores directo e inverso en ambos lados de la posiciïn de SNP.

3. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 precedentes, en el que cada sonda permite la detecciïn instantïnea por hibridaciïn con el amplicïn, incluyendo el hïbrido de sonda-amplicïn dicha posiciïn de SNP.

4. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones 1-3 precedentes, en el que cada sonda difiere de las demïs por su marcaje, que proporciona una seïal distinguible, y por su secuencia, que difiere en al menos un nucleïtido.

5. Mïtodo segïn cualquiera de las reivindicaciones 1-4 precedentes, en el que la evaluaciïn del valor de la variable discriminatoria para cada combinaciïn de dos sondas de detecciïn se realiza mediante la evaluaciïn de:

- las constantes de la velocidad de reacciïn de asociaciïn relativa (k1) de reacciones en que las dos sondas de detecciïn se unen a los amplicones; o

- las constantes de la velocidad de reacciïn de disociaciïn relativa (k2) de reacciones en que las dos sondas de detecciïn se disocian de los amplicones.

6. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 5, en el que los intervalos de valores que pueden alcanzar las variables discriminatorias derivadas de una combinaciïn de dos seïales de sonda pueden dividirse en intervalos usando umbrales, de tal modo que los valores que pueden alcanzar las variables discriminatorias para cada genotipo se agrupen en uno de estos intervalos.

7. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 6, en el que los valores que puede alcanzar la variable discriminatoria se dividen en tres intervalos usando umbrales.

8. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 6, en el que los valores que puede alcanzar la variable discriminatoria para una diana heterocigïtica se agrupan en el intervalo mediano.

9. Mïtodo segïn las reivindicaciones 4 y 6, en el que cuando los valores que puede alcanzar la variable discriminatoria se agrupan en el intervalo inferior, la secuencia diana es:

a. de tipo silvestre homocigïtico si la primera sonda permite la detecciïn del tipo mutante mientras que la segunda sonda permite la detecciïn del tipo silvestre,

b. de tipo mutante homocigïtico si la primera sonda permite la detecciïn del tipo silvestre mientras que la segunda muestra permite la detecciïn del tipo mutante.

10. Mïtodo segïn las reivindicaciones 4 y 6, en el que cuando los valores que puede alcanzar la variable discriminatoria se agrupan en el intervalo superior, la secuencia diana es:

a. de tipo silvestre homocigïtico si la primera sonda permite la detecciïn del tipo silvestre mientras que la segunda sonda permite la detecciïn del tipo mutante,

b. de tipo mutante homocigïtico si la segunda sonda permite la detecciïn del tipo silvestre mientras que la primera sonda permite la detecciïn del tipo mutante.