SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE SE PUEDEN USAR COMO CEBADORES Y SONDAS EN LA AMPLIFICACION Y LA DETECCION DE ADN DE VHS Y METODO PARA LA AMPLIFICACION Y DETECCION DE ADN DE VHS USANDO UNA AMPLIFICACION Y DETECCION DE ADN DE VHS USANDO UNA AMPLIFICACION BASADA EN LA TRANSCRIPCION.

Un par de cebadores de oligonucleótido para la amplificación del ácido nucleico del virus del herpes simple (VHS) que comprende:

a) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'- ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3', y b) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'- CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3'

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que pueden usarse en el campo del diagnóstico de virus, más específicamente, en el diagnóstico de infecciones del virus del herpes simple (VHS). La invención también se refiere a un método de amplificación basado en la transcripción para la amplificación de dianas de ADN usando tales secuencias de ácidos nucleicos.

Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos se usan en el campo de la biología molecular y la tecnología del ADN recombinante. Estos métodos se usan para cantidades

Se conocen varias técnicas de amplificación de ácidos nucleicos basadas en diferentes mecanismos de acción. Se conoce el método de amplificación de ácidos nucleicos con el nombre "reacción en cadena de la polimerasa" (PCR) descrito en las solicitudes de patente EP-A-0.200.362 y EP-A-0.201.148.

La presente invención también se refiere a una clase diferente de métodos de amplificación de ácidos nucleicos, a saber, "técnicas de amplificación basadas en la transcripción". Con estos métodos, se obtienen múltiples copias de ARN a partir de una plantilla de ADN que comprende un promotor funcional reconocido por la ARN polimerasa. Dichas copias de ARN se usan como diana a partir de la cual se obtienen nuevas plantillas de ADN, etc. Gingeras et al. en el documento WO-A-88/10315 y Burg et al. en el documento WO-A-89/1050 han descrito dichos métodos. Se han descrito técnicas de amplificación basadas en la transcripción isotérmica por Davey en el documento EP-A-0.323.822 (que se refiere al método NASBA), por Gingeras et al. en el documento EP-A-0.373.960 y por Kacian et al. en el documento EP-A-0.408.295. Las reacciones de amplificación basadas en la transcripción también pueden realizarse con enzimas termoestables. Las amplificaciones basadas en la transcripción se realizan por lo general a una temperatura alrededor de los 41 grados Celsius. Las enzimas termoestables permiten que la reacción sea realizada a temperaturas más elevadas. Dicho método termoestable se describe en el documento EP-A-0.682.121 presentado en nombre de Toyo Boseki KK.

Los métodos que se describen en los documentos EP-A-0.323.822, EP-A

0.373.960 y EP-A-0.408.295 son métodos isotérmicos continuos. Con estos métodos, se requieren cuatro actividades enzimáticas para conseguir la amplificación:

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

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Algunas de estas actividades pueden combinarse en una enzima de modo que por lo general sólo son necesarias dos o tres enzimas. La transcriptasa inversa, tal como la transcriptasa inversa de AMV (virus de la mieloblastosis aviar) o MMLV (virus de la leucemia murina de Moloney) tienen tanto actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN como de ADN, y también actividad de inherente de RNAsa H. Además, puede añadirse una RNAsa a la mezcla de reacción de una reacción de amplificación basada en la transcripción, tal como la RNAsa H de E. coli.

Las ARN polimerasas dependientes del ADN sintetizan múltiples copias de ARN a partir de una plantilla de ADN incluyendo un promotor reconocido por la ARN polimerasa. Ejemplos de ARN polimerasas son las polimerasas de E. coli y bacteriofagos T7, T3 y SP6. Un ejemplo de una ARN polimerasa comúnmente usada con los métodos de amplificación basados en la transcripción es la polimerasa T7. Así, el promotor que se incorpora en la plantilla usada para producir múltiples copias del ARN sería entonces el promotor T7. Por lo general, la plantilla que comprende al promotor tiene que ser creada comenzando a partir del ácido nucleico que comprende la secuencia diana. Dicho ácido nucleico puede estar presente en el material de partida que se usa como entrada para la reacción de amplificación. El ácido nucleico presente en el material de partida contendrá por lo general la secuencia diana como parte de una secuencia mucho más larga. Pueden estar presentes otras secuencias de ácidos nucleicos tanto en el extremo 3' como en el 5' de la secuencia diana. La reacción de amplificación puede comenzarse juntando este ácido nucleico del material de partida, las enzimas apropiadas que proporcionan juntas las actividades anteriormente mencionadas y al menos uno, aunque por lo general dos oligonucleótido(s). Al menos, uno de estos oligonucleótidos debe comprender la secuencia del promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN.

Los métodos de amplificación basados en la transcripción son útiles, en particular, si el material de entrada es el ARN monocatenario, aunque pueda ser igualmente usado ADN monocatenario o bicatenario como material de entrada. Cuando se realiza un método de amplificación basado en la transcripción en una muestra con ARN monocatenario con otras secuencias tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de la secuencia diana el par de oligonucleótidos que se usan adecuadamente con los métodos que se describen en la técnica anterior consiste en:

- un primer oligonucleótido (denominado de forma general "promotor-cebador" "o

cebador directo") que es capaz de hibridarse al extremo 3' de la secuencia diana,

cuyo oligonucleótido tiene la secuencia de un promotor (preferiblemente el

promotor T7) unida a su extremo 5' (la parte que se hibrida de este oligonucleótido

tiene una polaridad opuesta cuando se usa el ARN diana como material de

entrada),

- un segundo oligonucleótido (denominado de forma general "cebador inverso")

que comprende el extremo 5' de la secuencia diana (este oligonucleótido tiene la

misma polaridad que el ARN diana).

Cuando se reúnen en una mezcla de reacción dicho par de oligonucleótidos, junto con todas las enzimas que tienen las actividades apropiadas y un aporte suficiente de los ribonucleótidos y desoxiribonucleotidos necesarios y se mantienen en las condiciones apropiadas (es decir, en las condiciones de tampón apropiadas y a la temperatura apropiada) durante un período suficiente de tiempo comenzará una reacción de amplificación isotérmica continua. Se han descrito muchas variantes del anterior tema en la técnica anterior. Una reacción de amplificación basada en la transcripción comprende la síntesis de transcripciones de ARN monocatenario a partir de una plantilla que comprende a un promotor (p.ej, el promotor T7) que es reconocido por una ARN polimerasa (p.ej, la ARN polimerasa de T7). Un cebador directo, que comprende la secuencia del promotor, sirve como cebador para iniciar la síntesis de una cadena de ADN complementario respecto al ARN diana.

El cebador será amplificado por la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN. La RNAsa H degradará el híbrido ARN-cADN formado. Esto permite la hibridación del cebador inverso específico al cADN. La extensión de este cebador por la ADN polimerasa dependiente de ADN hasta el extremo 5' del cADN causa la formación de una secuencia del promotor bicatenaria, por lo cual la secuencia del promotor que era parte del cebador directo se usa como plantilla. Este promotor bicatenario será usado entonces por la ARN polimerasa dependiente de ADN para producir muchas nuevas moléculas de ARN que son complementarias al ARN diana. Después de esta fase de iniciación, la amplificación entra en una fase cíclica.

En la práctica, se producirá la secuencia entera de acontecimientos, que comienza a partir del ARN monocatenario en la muestra,...

1. Un par de cebadores de oligonucleótido para la amplificación del ácido nucleico del virus del herpes simple (VHS) que comprende:

a) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3', y

b) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3'.

2. Un par de cebadores de oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos oligonucleótidos está operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico del promotor.

3. Un método para amplificar un ADN de VHS diana opcionalmente presente en una muestra, que comprende las etapas de:

- incubar la muestra en un tampón de amplificación con:

- una o varias enzimas de restricción capaces de dividir el ADN de VHS en un sitio de restricción seleccionado, creando dicha enzima de restricción un extremo 3' definido sobre una de las cadenas de ADN, y

- un promotor-cebador, teniendo dicho promotor-cebador una región 5' que comprende la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente del ADN y una región 3' que comprende la secuencia de un primer cebador y complementaria al extremo 3' definido de la cadena de ADN, teniendo el primer cebador 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

5'-CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3',

- un segundo cebador, que tiene la polaridad opuesta del promotor-cebador y que comprende el extremo 5' de la secuencia diana, teniendo el segundo cebador 1050 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

5'-ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3',

- mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra una digestión por la enzima de restricción, en presencia de los trifosfatos de nucleosido apropiados, y

- someter la muestra así obtenida a un tratamiento térmico a una temperatura y tiempo suficientes para inactivar la(s) enzima(s) de restricción y/u, opcionalmente, producir al menos parcialmente el bicatenario monocatenario,

- añadir los siguientes reactivos a la muestra:

- una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN,

- una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN,

- una enzima que tiene actividad de RNAsa H,

- una enzima que tiene actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y

- mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas

durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra la amplificación.

4. El método según la reivindicación 3, en el que el ADN es ADN bicatenario de VHS.

5. El método según la reivindicación 3, en el que el ADN es monocatenario y la función del promotor-cebador y la función del cebador de restricción se combinan usando un promotor combinado y el cebador de restricción que comprende una secuencia complementaria a la región incluyendo el sitio de restricción del ADN monocatenario diana y la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente del ADN.

6. El método según la reivindicación 3, en el que se usa una transcriptasa inversa combinando las actividades de la enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN y de la enzima que tiene actividad de ADN dependiente de ADN.

7. El método según la reivindicación 3, en el que se usa una transcriptasa inversa que tiene actividad inherente de RNAsa H sustituyendo tres enzimas, a saber la enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN, la enzima que

tiene actividad de ADN dependiente de ADN así como la enzima que tiene actividad de RNAsa H.

8. El método según la reivindicación 3, en el que la temperatura de incubación es de 35ºC a aproximadamente 45 ºC y preferiblemente de aproximadamente 37-41ºC.

9. El método según la reivindicación 3, en el que la etapa de calentamiento se realiza a una temperatura entre 92ºC y 98 ºC y preferiblemente a aproximadamente 95ºC.

10. El método según la reivindicación 3, en el que se usa una enzima de restricción que corta el ADN de VHS en un sitio que es conservado entre los genotipos diferentes de VHS.

11. El método para la detección del ácido nucleico de VHS en una muestra en el que la muestra se somete a una reacción de amplificación de ácido nucleico usando un par de oligonucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y reactivos de amplificación adecuados y se detecta la presencia de cualquier ácido nucleico amplificado.

12. El método según la reivindicación 11, en el que la detección de cualquier ácido nucleico amplificado se realiza haciendo reaccionar la muestra con al menos un oligonucleótido seleccionado de una sonda de oligonucleótido del tipo no específica para la detección de VHS tipo 1 y/o tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GAAAAAAGTACATCGGCGTCATCT-3', una sonda de oligonucleótido del tipo específica para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTACGGGGGTAAG-3', una sonda de oligonucleótido del tipo específica para la detección de VHS tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTGCGGGGGCAAG-3', o con un par de sondas de oligonucleótido específico del tipo para la detección de VHS tipo 1 y tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de

longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3' [tipo 1], y 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3' [tipo 2] en condiciones de hibridación adecuadas y detectando la presencia del marcador en cualquier híbrido formado entre la secuencia amplificada y la(s) sonda(s).

13. El método según la reivindicación 11, en el que la técnica de amplificación usada es una técnica de amplificación basada en la transcripción, preferiblemente el NASBA, y el primer oligonucleótido está provisto de una secuencia promotora reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN.

14. Un método para la detección de VHS en una muestra, que comprende las etapas de:

(a) amplificar el ADN de VHS según cualquiera de las reivindicaciones 3-10 para obtener ARN monocatenario,

(b) hibridar al ARN amplificado unas sondas de oligonucleótido específicas del tipo seleccionadas de una sonda de oligonucleótido no específica del tipo para la detección de VHS tipo 1 y/o tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GAAAAAAGTACATCGGCGTCATCT-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTACGGGGGTAAG-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3',

(c) detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.

15. Un método para la detección de VHS tipo 1 en una muestra, que comprende las etapas de:

(a) amplificar el ADN de VHS según cualquiera de las reivindicaciones 3-10 para obtener ARN monocatenario,

(b) hibridar al ARN amplificado una sonda de oligonucleótido específica para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTACGGGGGTAAG-3', y

(c) detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.

16. Un método para la detección de VHS tipo 2 en una muestra, que comprende las etapas de:

(a) amplificar el ADN de VHS según cualquiera de las reivindicaciones 3-10 para obtener ARN monocatenario,

(b) hibridar al ARN amplificado una sonda de oligonucleótido específica para la detección de VHS tipo 2, teniendo dicha sonda 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y comprendiendo al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTGCGGGGGCAAG-3', o su secuencia complementaria;

(c) detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.

17. El uso de un par de oligonucleótidos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en una reacción de amplificación de ácido nucleico o como una sonda para la detección de ácido nucleico de VHS en una muestra.

18. El kit de ensayo para la detección de VHS en una muestra que comprende: -un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, -un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico

sustancialmente complementaria a al menos parte de la secuencia de ácido nucleico amplificada, provista de un marcador detectable, seleccionada de una sonda de oligonucleótido no específica del tipo para la detección de VHS tipo 1 y/o tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GAAAAAGTACATCGGCGTCATCT-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-31, o con un par de sondas de oligonucleótido específicas del tipo para la detección de VHS tipo 1 y tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en:

5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3' [tipo 1], y 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3' [tipo 2],

- reactivos de amplificación adecuados, -opcionalmente al menos una enzima de restricción.

19. Un kit para detectar y opcionalmente identificar VHS en una muestra, en el que el kit comprende un par o cebadores, en el que el primer cebador comprende una secuencia promotora de ARN polimerasa y una secuencia hibridante y que tiene 10-50 nucleótidos de longitud, y preferiblemente que tiene 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en 5'-CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3', y la segunda secuencia de cebador que tiene 10-50 nucleótidos de longitud, y preferiblemente que tiene 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en 5'-ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3'.

20. El kit según la reivindicación 19, que comprende además una sonda de oligonucleótido que contiene una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse a la región del ADN amplificado usando el primer cebador y el segundo cebador.

21. El kit de ensayo según la reivindicación 18, en el que los reactivos de amplificación adecuados hacen posible una técnica de amplificación basada en la transcripción, preferiblemente el NASBA.