Secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos del VIH-1.

Par de oligonucleótidos, para uso como un conjunto de cebadores en la amplificación de una secuenciadiana situada dentro de la región LTR del genoma de VIH-1,

consistiendo dicho par en un primer oligonucleótido quetiene una longitud de 26-50 nucleótidos y que comprende la secuencia:

SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA

y un segundo oligonucleótido que tiene una longitud de 15-26 nucleótidos y que comprende al menos un fragmentode 10 nucleótidos de la secuencia:

SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA

en donde el primer oligonucleótido está provisto de una secuencia de promotor reconocida por una RNA-polimerasadependiente de DNA y la amplificación es una amplificación basada en la transcripción

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10183902.

Solicitante: BIOMERIEUX B.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: BOSEIND 15 5281 RM BOXTEL PAISES BAJOS.

Inventor/es: OUDSHOORN, PIETER, GOUDSMIT, JAAP, JURRIAANS, SUZANNE, LUKASHOV, VLADIMIR VLADIMIROVICH.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/09 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.

PDF original: ES-2438578_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos del VIH-1

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar en el campo de los diagnósticos de virus, más específicamente el diagnóstico de infecciones con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) causado por el virus de la inmunodeficiencia humana (abreviadamente en lo sucesivo VIH en español, correspondiente a la abreviatura inglesa HIV) .

Aunque los diagnósticos convencionales de virus se han basado predominantemente en la detección de antígenos virales o sus anticuerpos específicos, en los últimos años la atención se ha desplazado hacia métodos para la detección directa del genoma de los virus o las secuencias de ácidos nucleicos procedentes de dicho genoma, tanto RNA como DNA. Estos métodos se basan usualmente en hibridación de ácidos nucleicos. La hibridación de ácidos nucleicos se basa en la capacidad de las dos cadenas de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias en asociarse una con la otra en condiciones apropiadas, formando por tanto una estructura de dos cadenas o bicatenaria. Cuando se marca la cadena complementaria, se puede detectar el marcador y es indicativo de la presencia de la secuencia diana. Especialmente en combinación con los métodos para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos, estos métodos han llegado a ser una herramienta importante en el diagnóstico viral, en particular para la detección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) .

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos son especialmente útiles como otra técnica más en casos en los que los métodos serológicos den resultados dudosos o en casos en los que puede haber un periodo de tiempo considerable entre la infección y el desarrollo de anticuerpos para el virus. Con el VIH, la seroconversión puede ocurrir usualmente unos 3-6 meses después de la exposición al virus. Por tanto, mientras que no se detecten anticuerpos con inmunoensayos convencionales, el DNA proviral o el RNA viral circulante puede ser ya detectable. También en monitorización de terapias antivirales, los métodos basados en amplificación de ácidos nucleicos tienen varias ventajas sobre los métodos serológicos. Especialmente los métodos de amplificación cuantitativa proporcionan una herramienta útil para determinar los cambios en la cantidad de virus presentes antes y durante la terapia.

La elección de los oligonucleótidos que se han de usar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos es crítica para la sensibilidad y especificidad del ensayo. La secuencia que ha de ser amplificada está usualmente presente solo en una muestra (por ejemplo una muestra de sangre obtenida de un paciente que se sospecha que tiene una infección viral) en cantidades minúsculas. Los cebadores deben ser suficientemente complementarios de la secuencia diana para permitir una amplificación eficaz del ácido nucleico viral presente en la muestra. Si los cebadores no se asocian adecuadamente (debido a un desapareamiento de las bases de los nucleótidos en ambas cadenas) con la secuencia diana, la amplificación se obstaculiza fuertemente. Esto afectará a la sensibilidad del ensayo y puede dar lugar a resultados de ensayo negativos falsos. Debido a la heterogeneidad de los genomas virales se pueden obtener resultados de ensayo negativos falsos si los cebadores y las sondas son capaces de reconocer secuencias presentes en solamente parte de las variantes del virus. El virus VIH muestra una alta heterogeneidad. La variabilidad genética ha sido demostrada entre aislados de diferentes continentes pero también entre individuos y entre diferentes fases o etapas de la enfermedad. Basándose en análisis de secuencias se han identificado dos grupos dentro del VIH-1: el grupo M (debiéndose la letra M al término inglés "major" (principal) ) , y el grupo O (debiéndose la letra O al término inglés "outlier" (raro) ) . Dentro del grupo M, han sido asignados los subtipos (A-H) que constituye cada uno un conjunto separado filogenético de secuencias, y están siendo identificados otros subtipos. Esta variación de secuencias no está distribuida uniformemente a lo largo del genoma. El genoma de VIH-1 como todos los genomas retrovirales, consiste aproximadamente en las siguientes regiones: El gen gag del genoma de VIH-1 es la región que codifica las proteínas del núcleo del virus (por ejemplo, p24) . El gen env codifica una proteína precursora grande, gp160, que es procesada en las proteínas de la envolvente gp120 y gp41. El gen pol codifica la polimerasa del virus (transcriptasa inversa) . Las regiones terminales repetidas largas (abreviadamente en lo sucesivo LTR por la expresión inglesa Long Terminal Repeat) son las regiones del genoma viral que participan en la integración del virus con la célula hospedante y en la regulación de la transcripción de los genes virales. Algunas regiones son más propensas que otras a variaciones de secuencia. Especialmente en el dominio env la variación de secuencia puede ser tan alta como 30% entre miembros de los diferentes subtipos. Idealmente, la selección del cebador se debe basar en el conocimiento de la variabilidad entre cepas en las secuencias del cebador candidato y las consecuencias del desapareamiento en los sitios del cebador. McCutchan et al., J. AIDS, 4, 1241-1250, 1991, usaron la reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo abreviadamente PCR) para realizar una comparación genética de diferentes aislados del VIH-1. Usando la PCR anclada (se usaron cebadores de sentido variable con un cebador antisentido constante. Los cebadores fueron elegidos de regiones relativamente conservadas en gag, env y LTR) . También se investigó el efecto del desapareamiento de cebadores sobre la cantidad de producto de obtenido por la PCR. El desapareamiento en el extremo 3' del cebador disminuyó la cantidad de producto en algunas ocasiones más de 100 veces.

La detección de todos los subtipos actualmente conocidos del VIH-1 es de gran importancia, especialmente con respecto al tratamiento del paciente, la seguridad de la sangre y hemoderivados y estudios clínicos y epidemiológicos. Los ensayos actuales para la amplificación y subsiguiente detección de secuencias de ácidos nucleicos procedentes del VIH-1 se basan usualmente en la amplificación de secuencias de la región gap del genoma viral. Estos

ensayos se han desarrollado para el subtipo B, que es el subtipo principal en los países europeos y en los Estados Unidos de América. Sin embargo, la presencia de otros subtipos, que antes estaban confinados geográficamente, es creciente debido a los frecuentes viajes entre estos países y, por ejemplo, los países africanos. Por tanto, se necesitan ensayos sensibles que sean capaces de detectar tantas variantes del virus VIH-1 como sea posible, preferiblemente todas.

La investigación dirigida a identificar conjuntos de cebadores adecuados para la amplificación viable de secuencias de ácidos nucleicos derivados VIH-1 ha ido creciendo durante los pasados años. Engelbrecht et al., J. Virol. Meth., 55, 391-400, 1995, describen un estudio dirigido al desarrollo de un protocolo de PCR específico y sensible usando pares de cebadores para env, gag y LTR para detectar subtipos presentes en Western Cape, Sudáfrica. Se analizaron veinticuatro cepas que se sabía que pertenecían a los subtipos B, C y D. Se encontró que el comportamiento de los pares de cebadores era muy dependiente de la optimización de las condiciones de reacción para los diferentes pares de cebadores. Solamente cuando se usaron condiciones menos rigurosas (por ejemplo, con el par de cebadores para LTR se requirieron un tiempo de ciclo más largo y menores temperaturas de asociación) pudieron detectarse estas cepas particulares del VIH con suficiente sensibilidad y reproductibilidad con todos los pares de cebadores.

Zazzi et al., J. Med. Virol., 38, 172-174, 1992, desarrollaron una PCR de dos etapas (usando cebadores anidados) para la detección del DNA del VIH-1 en muestras clínicas. Los cebadores usados para la amplificación procedían del gen gag y la región LTR. Los pacientes analizados en este estudio eran todos de zonas próximas, lo que probablemente hace que representen solamente un número limitado de cepas virales diferentes.

Vener et al., en Bio Techniques, 21, 248-255, 1996, describieron un método de PCR cuantitativa que usaba cebadores anidados precedentes de LTR. Este método se analizó solamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) infectadas con VIH-1 MN. Por tanto, no se puede decir nada acerca de la idoneidad de los cebadores usados para detectar diferentes subtipos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Par de oligonucleótidos, para uso como un conjunto de cebadores en la amplificación de una secuencia diana situada dentro de la región LTR del genoma de VIH-1, consistiendo dicho par en un primer oligonucleótido que tiene una longitud d.

2. 50 nucleótidos y que comprende la secuencia:

SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA

y un segundo oligonucleótido que tiene una longitud de 15-26 nucleótidos y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de la secuencia:

SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA

en donde el primer oligonucleótido está provisto de una secuencia de promotor reconocida por una RNA-polimerasa 10 dependiente de DNA y la amplificación es una amplificación basada en la transcripción.

2. Método para la detección de ácido nucleico del VIH-1 en una muestra, en la que la muestra se somete a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos basada en la transcripción usando un par de oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 y reactivos de amplificación adecuados, y se detecta la presencia de cualquier ácido nucleico amplificado.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la detección de cualquier ácido nucleico amplificado se realiza haciendo reaccionar la muestra con un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT,

que está provisto de un marcador detectable, en condiciones de hibridación adecuadas, y detectando la presencia del marcador en cualquiera de los híbridos formados entre la secuencia amplificada y la sonda.

4. Kit de ensayo para la detección de VIH-1 en una muestra que comprende:

- un par de oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1,

- un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente complementaria de 25 al menos parte de la secuencia de ácidos nucleicos amplificada, provisto de un marcador detectable y

- reactivos de amplificación adecuados.

5. Uso de un par de oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, como un conjunto de cebadores en la amplificación de una secuencia diana situada dentro de la región LTR del genoma del VIH-1.


 

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