Método de monitorización de la progresión de la enfermedad de Alzheimer por medición de un biomarcador.

Método in vitro de monitorización de la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un paciente,

que comprende la medición de un biomarcador molecular específico de la enfermedad de Alzheimer ("ADSMB"), en el que la proporción del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en células del paciente que han sido estimuladas por un activador de proteína quinasa C, restando la proporción del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en células de dicho paciente que han sido estimuladas con una solución de control que carece del activador de proteína quinasa C.

Mïtodo de monitorizaciïn de la progresiïn de la enfermedad de Alzheimer por mediciïn de un biomarcador

SECTOR DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn se refiere a un mïtodo in vitro de monitorizaciïn de la progresiïn de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende la mediciïn de un biomarcador molecular especïfico de la enfermedad de Alzheimer (ADSMB) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

Se ha sugerido que la perturbaciïn de la homeostasis del calcio intracelular, los niveles incrementados de estrïs oxidativo, y los mecanismos inflamatorios que dan lugar a una toxicidad excitatoria y la muerte neuronal, contribuyen a la patogïnesis de la enfermedad de Alzheimer (AD) (Ito y otros 1994, Putney, 2000; Yoo y otros, 2000; Sheehan y otros, 1997; De Luigi y otros, 2001; Anderson y otros, 2001; Remarque y otros, 2001) . A partir de estudios que utilizaban bradiquinina como estïmulo se han derivado una serie de anormalidades asociadas con AD en los niveles de Ca2+ intracelular y otros procesos celulares. Como potente mediador de la inflamaciïn, la bradiquinina (BK) es producida por el cerebro y las cïlulas perifïricas bajo condiciones patofisiolïgicas, tales como trauma, apoplejïa, dolor isquïmico y asma (Regoli y otros, 1993; Bockmann y Paegelow, 2000; Ellis y otros, 1989; Kamiya y otros, 1993) . Al actuar sobre el receptor de bradiquinina B2 (BK2bR) , un receptor acoplado a la proteïna G, la BK desencadena la generaciïn de fosfatidilinositol (PI) a travïs de la actividad de fosfolipasa C (PLC) , el cual a su vez produce inositol 1, 4, 5-trifosfato (IP3) que incrementa la liberaciïn de Ca2+ intracelular de los almacenes sensibles a IP3 (Noda y otros, 1996; Venema y otros, 1998; Wassdal y otros, 1999; Cruzblanca y otros, 1998; Ricupero y otros, 1997; Pascale y otros, 1999) . A travïs del mismo mecanismo, la BK tambiïn desencadena la producciïn de otras citoquinas proinflamatorias mediante la activaciïn de proteïnas quinasas activadas por mitïgeno (MAP) (Hayashi y otros, 2000; Schwaninger y otros, 1999; Phagoo y otros, 2001) . Se ha observado un mayor aumento en los niveles de Ca2+ intracelular en cerebros con AD, asï como en cïlulas perifïricas de AD en respuesta a la estimulaciïn de bradiquinina y la inactivaciïn de los canales de K+ (Etcheberrigaray y otros, 1993, 1998; Hirashima y otros, 1996; Gibson y otros, 1996 (a) ) .

La estimulaciïn de PLC posterior a la activaciïn de BK2bR tambiïn conduce a la producciïn de diacilglicerol que, junto con un Ca2+ intracelular aumentado, activa isoformas de proteïna quinasa C (PKC) . La cascada PLC/fosfolïpidos-Ca2+/PKC activada por BK interacciona con el mecanismo de seïalizaciïn Ras/Raf, el cual activa quinasas 1/2 reguladas por seïal extracelular (Erk 1 y Erk 2, que se denominan en conjunto como “Erk1/2”) , un subtipo de la familia de MAP quinasas (Berridge, 1984; Bassa y otros, 1999; Hayashi y otros, 2000; Blaukat y otros, 2000, Zhao y otros, Neurobiology of Disease 11, 166-183, 2002) . Erk1/2 recibe seïales de mecanismos de transducciïn de seïales mïltiples y conduce a la proliferaciïn y diferenciaciïn celular mediante la regulaciïn de la expresiïn gïnica a travïs de un conjunto de factores transcripcionales, incluyendo AP-1, NF-κB y proteïna de uniïn a elementos sensibles a AMP cïclico (CREB) . Al actuar como una de las principales quinasas, Erk2 fosforila tau en mïltiples sitios de serina/treonina incluyendo Ser-262 y SER-356 (Reynolds y otros, 1993; Lu y otros, 1993) . Ademïs, se ha observado por diferentes laboratorios (Desdouits-Magnen y otros, 1998; Gasparini y otros, 2001; Nitsch y otros, 1994, 1995, 1996, 1998) que los mecanismos asociados a la MAP quinasa activada por PKC y al receptor de BK regulan la formaciïn y secreciïn de la forma soluble de la proteïna precursora de amiloides (APP) . Estos descubrimientos han sugerido la posibilidad de que el procesamiento de APP asociada a BK pueda estar unido al mecanismo de PKC-MAP quinasa. Por otro lado, afecciones patolïgicas, tales como infecciones virales, estrïs oxidativo incrementado, expresiïn aberrante de APP y la exposiciïn a APβ provocan la activaciïn de MAP quinasa (Rodems y Spector, 1998; McDonald y otros, 1998; Ekinci y otros, 1999; Grant y otros, 1999) y una mayor fosforilaciïn de tau (Greenberg y otros, 1994; Ekinci y Shea, 1999; Knowles y otros, 1999) . Estos efectos implican la alteraciïn de un mecanismo o mecanismos de seïalizaciïn de MAP quinasa en la patogïnesis de AD.

Las proteïnas quinasas activadas por mitïgeno (tales como Erk1 y Erk2) regulan la fosforilaciïn de la proteïna tau asociada a microtïbulos y el procesamiento de la proteïna β amiloide, ambos hechos crïticos para la patofisiologïa de la enfermedad de Alzheimer. La fosforilaciïn incrementada y prolongada de Erk1/2 en respuesta a la bradiquinina se ha detectado en fibroblastos de la enfermedad de Alzheimer tanto familiar como esporïdica, pero no en controles relacionados con la edad (Zhao y otros, Neurobiology of Disease 11, 166-183, 2002) . La fosforilaciïn prolongada de Erk1/2 inducida por bradiquinina se ha observado previamente en fibroblastos de la enfermedad de Alzheimer y es la materia del documento WO 02/067764.

El documento WO 03/102016 A2 se refiere al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. El documento da a conocer que la utilizaciïn de insulisina para hidrolizar los pïptidos Aβ representa una estrategia terapïutica alternativa para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Existe la necesidad de pruebas muy sensibles y especïficas para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer y para cribar compuestos ïtiles en el tratamiento y la prevenciïn de la enfermedad de Alzheimer. Los presentes inventores han identificado, por primera vez, biomarcadores moleculares ïnicos especïficos de la enfermedad de Alzheimer

ïtiles para el diagnïstico de la enfermedad de Alzheimer de una manera muy sensible y especïfica en comparaciïn con las pruebas de diagnïstico conocidas previamente. De este modo, los biomarcadores moleculares ïnicos especïficos de la enfermedad de Alzheimer dados a conocer en el presente documento sirven como base para mïtodos de diagnïstico que tienen un grado elevado de sensibilidad y especificidad para la monitorizaciïn de la progresiïn de la enfermedad de Alzheimer.

DESCRIPCIïN RESUMIDA DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn estï dirigida a mïtodos in vitro de monitorizaciïn de la progresiïn de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende la mediciïn de un biomarcador molecular especïfico de la enfermedad de Alzheimer (“ADSMB”) , en el que el ADSMB es la proporciïn del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas del paciente que han sido estimuladas por un activador de proteïna quinasa C, restando la proporciïn del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas de dicho paciente que han sido estimuladas con una soluciïn de control que carece del activador de proteïna quinasa C.

La presente invenciïn estï dirigida a mïtodos in vitro de monitorizaciïn de la progresiïn de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende las etapas de poner en contacto cïlulas obtenidas de un paciente con un agente que es un activador de proteïna quinasa C y medir la proporciïn del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en las cïlulas, restando la proporciïn del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas de dicho paciente que han sido estimuladas con una soluciïn de control que carece del activador de proteïna quinasa C. Los mïtodos de diagnïstico de la presente invenciïn son mïtodos in vitro. En realizaciones todavïa mïs preferentes de los mïtodos de diagnïstico, las proteïnas MAP quinasas fosforiladas especïficas son variantes de secuencia entre sï y pertenecen a la misma familia de proteïnas.

En la presente invenciïn, la proporciïn de proteïnas quinasa MAP fosforiladas especïficas es la proporciïn de Erk1 fosforilada con respecto a Erk2 fosforilada y se puede calcular mediante la divisiïn de la cantidad normalizada de Erk1 fosforilada por la cantidad normalizada de Erk2 fosforilada. En realizaciones preferentes de la presente invenciïn, el activador de proteïna quinasa C se selecciona del grupo que comprende bradiquinina, briostatina, bombesina, colecistoquina, trombina, prostaglandina F2α y vasopresina.

En ciertas realizaciones de la presente invenciïn, las cïlulas que se utilizan en los ensayos de diagnïstico son cïlulas perifïricas. En realizaciones preferentes, las cïlulas pueden ser cïlulas de la piel, cïlulas de fibroblastos de la piel, cïlulas de la sangre o... [Seguir leyendo]

1. Mïtodo in vitro de monitorizaciïn de la progresiïn de la enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende la mediciïn de un biomarcador molecular especïfico de la enfermedad de Alzheimer (“ADSMB”) , en el que la proporciïn del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas del paciente que han sido estimuladas por un activador de proteïna quinasa C, restando la proporciïn del nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas de dicho paciente que han sido estimuladas con una soluciïn de control que carece del activador de proteïna quinasa C.

2. Mïtodo in vitro, segïn la reivindicaciïn 1, que comprende ademïs la mediciïn de la proporciïn de Erk1 fosforilada con respecto a Erk2 fosforilada en mïs de un momento de tiempo.

3. Mïtodo in vitro, segïn la reivindicaciïn 1, en el que una disminuciïn en la proporciïn de Erk1 fosforilada con respecto a Erk2 fosforilada es indicativa de la progresiïn de la enfermedad de Alzheimer en dicho paciente. 15

4. Mïtodo in vitro, segïn la reivindicaciïn 1, en el que dicho activador de proteïna quinasa C es bradiquinina.

5. Mïtodo in vitro, segïn la reivindicaciïn 4, en el que el nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas del paciente que han sido estimuladas por dicho activador de proteïna quinasa C y el nivel de

Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas de dicho paciente que han sido estimuladas con dicha soluciïn de control que carece del activador de proteïna quinasa C, es cada una de ellas una proporciïn normalizada, en el que la proporciïn normalizada representa el grado de fosforilaciïn de Erk1 o Erk2.

6. Mïtodo in vitro, segïn la reivindicaciïn 4, en el que el nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2

fosforilada en cïlulas del paciente que han sido estimuladas por dicho activador de proteïna quinasa C y el nivel de Erk1 fosforilada con respecto al nivel de Erk2 fosforilada en cïlulas de dicho paciente que han sido estimuladas con dicha soluciïn de control que carece del activador de proteïna quinasa C, es cada una de ellas una cantidad normalizada.

7. Mïtodo in vitro, segïn la reivindicaciïn 4 o la reivindicaciïn 5, en el que la proporciïn de Erk1 fosforilada con respecto a Erk2 fosforilada se mide en cïlulas extraïdas del paciente en mïs de un momento de tiempo.

8. Mïtodo in vitro, segïn la reivindicaciïn 6 o la reivindicaciïn 7, en el que una disminuciïn en el valor numïrico de la proporciïn de Erk1 fosforilada con respecto a Erk2 fosforilada es indicativa de la progresiïn de la enfermedad de 35 Alzheimer en dicho paciente.