Marcadores de perfil genómico inducidos por un estímulo que marcan la enfermedad de Alzheimer.

Procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:



i) poner en contacto una población de células de fibroblastos de piel de prueba obtenidas de un sujeto sospechoso de tener la enfermedad de Alzheimer con un agente que es un activador de proteína quinasa C; y

ii) detectar cambios en la expresión de uno o más genes en las células de fibroblastos de piel de prueba cuando se comparan con la expresión de los mismos uno o más genes en células de células de fibroblastos de piel de control obtenidas de un individuo sin la enfermedad de Alzheimer,

en el que un cambio en la expresión génica en las células de fibroblastos de piel de prueba en comparación con la expresión génica en las células de fibroblastos de piel de control indica que el individuo tiene la enfermedad de Alzheimer,

el cambio en la expresión génica detectada en las células de fibroblastos de piel de prueba en comparación con las células de fibroblastos de piel de control es un incremento en la expresión génica o una disminución en la expresión génica,

dicho uno o más genes que presentan una disminución en la expresión génica se seleccionan del grupo que comprende los genes que tienen los números de acceso del banco de genes NM_020979.1, BC000284.1, NM_001037.1, NM_003832.1, NM_022078.1, AI492892, T86629, AW418666, AW468880, NM_005399.1, BF433071, NM_152902.1, AI679073, NM_006902.2, BF000166, NM_001684.1, AI813654, AI492892, y dicho uno o más genes que presentan un incremento en la expresión génica se seleccionan del grupo que comprende los genes que tienen los números de acceso del banco de genes AW238632, AW611729, AV740879, AA639752, AF088033, AW182938, AL031282, BF430956, AW956580, AI394529, AL137364.1, NM_001452.1, BF111616, AI457436, AF056433, NM_014574.1, NM_013233.1, AI017106, AI927770, BG291787, AI760760, NM_003760.2, NM_022346.1, AI816281, NM_016374.2, AW963328, AA147933, BC005357.1, BG534245, D50683.1, BU689502, NM_005154.1, R60866, AI823905, y NM_018098.1.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/051931.

Solicitante: BLANCHETTE ROCKEFELLER NEUROSCIENCES INSTITUTE.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 8 Medical Center Drive Morgantown, WV 26505-3409 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ALKON, DANIEL, L., KHAN,TAPAN,KUMAR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

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Fragmento de la descripción:

Marcadores de perfil genómico inducidos por un estímulo que marcan la enfermedad de Alzheimer

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer utilizando perfiles de expresión génica inducida por PKC.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de memoria y las funciones cognitivas. La demencia asociada con la AD se denomina como demencia senil de tipo Alzheimer (SDAT) cuando se utiliza con la enfermedad de Alzheimer. La AD se caracteriza clínicamente por la pérdida progresiva de memoria, cognición, razonamiento, juicio y estabilidad emocional que conduce de manera gradual a un deterioro mental profundo y, finalmente, la muerte. Aunque existen muchas hipótesis para los posibles mecanismos de la AD, una teoría central es que la formación excesiva y la acumulación de péptidos beta-amiloide (Aβ) tóxicos, ya sea directa o indirectamente, afecta a una variedad de eventos celulares y conduce a un daño neuronal y la muerte celular (Selkoe, Neuron. 1991; 6 (4) : 487-98, 1991; Selkoe, J Clin Invest. 2002; 110 (10) : 1375-1381) .

La AD es un trastorno progresivo con una duración promedio de alrededor de 8 a 15 años entre el inicio de los síntomas clínicos y la muerte. Se cree que la AD representa la séptima causa médica más habitual de muerte y afecta a aproximadamente 5 millones de personas en los Estados Unidos. Se espera que la prevalencia alcance los 7, 7 millones antes del 2030. Aproximadamente 1 de cada 8 personas mayores de 65 años, el 13% de esta población, tiene AD (Asociación del Alzheimer 2008 Alzheimer’s Disease Facts and Figures (“Hechos y cifras sobre la enfermedad de Alzheimer”) ) . La AD afecta actualmente a aproximadamente 15 millones de personas en todo el mundo (incluyendo todas las razas y grupos étnicos) y debido al aumento relativo de personas mayores en la población, su prevalencia probablemente aumentará en las próximas dos o tres décadas. La AD es actualmente incurable.

Hasta ahora, existen limitadas oportunidades para la intervención profiláctica para la AD debido a la insuficiencia de procedimientos de diagnóstico. En la actualidad, un diagnóstico definitivo de AD requiere la observación de lesiones en el tejido cerebral de pacientes post-mortem o, raramente, en pequeñas muestras de biopsias de tejido cerebral tomadas durante un procedimiento neuroquirúrgico invasivo. Sin embargo, los médicos intentan de manera rutinaria distinguir la AD de otras formas de demencia basadas en una serie de síntomas que dependen de la correlación conocida entre dichos síntomas y las lesiones observadas en las biopsias. Entre las pruebas utilizadas actualmente para diagnosticar la AD se incluyen combinaciones de cuestionarios cualitativos, tales como el mini examen del estado mental (MMSE) , mini examen cognitivo, estudio cooperativo de la AD-actividades a escala de la vida diaria (ADCS-ADL) ; evaluación física y neurológica; y obtención de imágenes cerebrales estructurales (MRI, CT) y funcionales (PET; FDG-PET) . Estas pruebas se realizan habitualmente para descartar otras enfermedades o afecciones en lugar de proporcionar un diagnóstico definitivo de la AD.

Existen algunos procedimientos para la detección de biomarcadores patogénicos para la AD, tales como Aβ, Tau, y la proteína de la cadena neural/AD7C en sujetos vivos. Por ejemplo, la detección de Aβ en un sujeto vivo incluye la detección directa (por imágenes) o indirecta (bioquímica) . La obtención de imágenes in vivo de Aβ se puede conseguir utilizando derivados de flavona radioyodados como agentes de obtención de imágenes (Ono y otros, J Med Chem 2005; 48 (23) : 7253-60) y con colorantes de unión a amiloide, tales como putresceína conjugada a un péptido A radioyodado de 40 residuos (que produce 125I-PUT-A 1-40) . Se observó que este agente cruzaba la barrera hemato-encefálica y se unía a las placas de Aβ (Wengenack y otros, Nature Biotechnology 2000; 18 (8) : 868-72) . También se observó la obtención de imágenes de Aβ utilizando estilbeno [11C]SB-13 y el benzotiazol [11C]6-OH-BTA-1 (también conocido como [11C]PIB) (Nicholaas y otros, Am J Geriatr Psychiatr y . 2004; 12: 584-595) .

La cuantificación de Aβ (1-40) en la sangre periférica también se ha demostrado utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada con espectrometría de masas en tándem en una trampa de iones lineal (Du y otros, J Biomol Tech. 2005; 16 (4) : 356-63) . También se ha descrito la detección de agregados proteínas Aβ individuales en el líquido cefalorraquídeo de pacientes de Alzheimer mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia (Pitschke y otros, Nature Medicine 1998; 4: 832-834) . La patente de Estados Unidos 5.593.846 describe un procedimiento para la detección de Aβ soluble. También se ha descrito la detección indirecta del péptido Aβ y receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE) utilizando anticuerpos. Por último, la detección bioquímica de aumento de la actividad de BACE-1 en el líquido cefalorraquídeo utilizando sustratos cromogénicos también se ha postulado como indicador del diagnóstico o pronóstico de la AD (Verheijen y otros, Clin Chem 2006;

52: 1168-1174) . Entre otros procedimientos se incluyen la detección de Tau, y la proteína de la cadena neural/AD7C en el líquido cefalorraquídeo.

En un intento de mejorar el tratamiento y el diagnóstico de la AD, se han generado numerosos perfiles de expresión génica para comparar genes expresados en el tejido cerebral post-mortem con los expresados en tejido cerebral normal utilizando diversas técnicas que incluyen microdisección de captura por láser en micromatrices (“microarrays”) (Loring y otros, DNA and Cell Biology 2001; 20 (11) : 683-95; Mufson y otros, Neurochem. Res. 2003; 27 (10) : 1035-1048; Dunckley y otros, Neurobiol Aging, 1 de octubre de 2005; Brooks y otros, Brain Res 2007; 1127 (1) : 127-35; Liang y otros, Physiological Genomics. 2008; 33: 240-256; Liang y otros, Proc Natl Acad Sci USA. 10 de marzo de 2008) . También se han generado algunos perfiles de expresión génica utilizando tejidos periféricos, tales como linfocitos o fibroblastos, en un intento de identificar los perfiles de expresión génica asociados con la AD familiar (hereditaria) o de evaluar el efecto de un tratamiento potencial en genes expresados diferencialmente (Nagasaka y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102 (41) : 14854-14859) .

Entre las medidas de diagnóstico actuales para la AD se incluyen la identificación de un núcleo clínico de la pérdida de memoria episódica temprana, progresiva y significativa más uno o más biomarcadores anormales (indicadores biológicos) característicos de la AD, incluyendo la atrofia (pérdida) del lóbulo temporal tal como se muestra en MRI; concentraciones anormales de proteína Aβ en el líquido cefalorraquídeo; un patrón específico que muestra un metabolismo de glucosa reducido en las exploraciones por PET del cerebro; y una mutación genética asociada con la familia inmediata.

Al igual que los exámenes físicos y mentales, los procedimientos anteriores no son todavía totalmente fiables o precisos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer porque los mismos patrones de genes se encuentran en otras enfermedades o afecciones. Como resultado, los costes del diagnóstico de la AD son enormes debido a las numerosas pruebas y especialistas involucrados y debido a la incapacidad para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer en etapas tempranas impide que los pacientes y sus familias planeen de manera adecuada el futuro, aumentando los costes de la atención a largo plazo. Además, las tasas estimadas de diagnósticos erróneos o de diagnósticos no definitivos están en el intervalo del 50-75%.

Sigue habiendo la necesidad de una manera más sencilla de conseguir diagnósticos más definitivos de la AD que sean menos costosos e invasivos, más precisos, y que se puedan utilizar en una etapa más temprana para una intervención más rápida. De manera destacada, debido a que el proceso neurodegenerativo y la pérdida sustancial de células comienza probablemente mucho antes de la manifestación de los síntomas cognitivos de la AD, una prueba de diagnóstico eficaz que pudiera diagnosticar la AD de manera más precisa, incluyendo la AD temprana e incluso una predisposición a la AD, tendría un valor incalculable.

El documento WO2006/054979 da a conocer un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (AD) mediante la medición del nivel de expresión de un único gen,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: i) poner en contacto una población de células de fibroblastos de piel de prueba obtenidas de un sujeto sospechoso de tener la enfermedad de Alzheimer con un agente que es un activador de proteína quinasa C; y ii) detectar cambios en la expresión de uno o más genes en las células de fibroblastos de piel de prueba cuando se comparan con la expresión de los mismos uno o más genes en células de células de fibroblastos de piel de control obtenidas de un individuo sin la enfermedad de Alzheimer,

en el que un cambio en la expresión génica en las células de fibroblastos de piel de prueba en comparación con la expresión génica en las células de fibroblastos de piel de control indica que el individuo tiene la enfermedad de Alzheimer, el cambio en la expresión génica detectada en las células de fibroblastos de piel de prueba en comparación con las células de fibroblastos de piel de control es un incremento en la expresión génica o una disminución en la expresión génica,

dicho uno o más genes que presentan una disminución en la expresión génica se seleccionan del grupo que comprende los genes que tienen los números de acceso del banco de genes NM_020979.1, BC000284.1, NM_001037.1, NM_003832.1, NM_022078.1, AI492892, T86629, AW418666, AW468880, NM_005399.1, BF433071, NM_152902.1, AI679073, NM_006902.2, BF000166, NM_001684.1, AI813654, AI492892, y dicho uno o más genes que presentan un incremento en la expresión génica se seleccionan del grupo que comprende los genes que tienen los números de acceso del banco de genes AW238632, AW611729, AV740879, AA639752, AF088033, AW182938, AL031282, BF430956, AW956580, AI394529, AL137364.1, NM_001452.1, BF111616, AI457436, AF056433, NM_014574.1, NM_013233.1, AI017106, AI927770, BG291787, AI760760, NM_003760.2, NM_022346.1, AI816281, NM_016374.2, AW963328, AA147933, BC005357.1, BG534245, D50683.1, BU689502, NM_005154.1, R60866, AI823905, y NM_018098.1.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el activador de proteína quinasa C se selecciona del grupo que comprende bradiquinina, briostatina, bombesina, colecistoquinina, trombina, prostaglandina F2-alfa o vasopresina.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichos uno o más genes presentan un incremento en la 30 expresión génica.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichos uno o más genes presentan una disminución en la expresión génica.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dichos uno o más genes, como mínimo, dos genes, en el que el cambio de expresión, como mínimo, de un gen de dichos, como mínimo, dos genes es un incremento en la expresión génica, y el cambio de expresión, como mínimo, de otro gen de dichos, como mínimo, dos genes es una disminución en la expresión génica.

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el cambio en la expresión génica se mide utilizando una micromatriz.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que la micromatriz es un grupo de ácidos nucleicos plurales unidos a sustrato de la célula de prueba y las células de control. 45

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico es ADNc.

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el cambio en la expresión génica se mide utilizando la reacción

en cadena de la polimerasa. 50

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que la reacción en cadena de la polimerasa es reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real.

11. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la enfermedad de Alzheimer es enfermedad de Alzheimer 55 esporádica.

12. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la enfermedad de Alzheimer es la enfermedad de Alzheimer de etapa temprana que se correlaciona con la fase 4 de la escala de clasificación de la evaluación funcional (FAST)

o la AD leve según los criterios definidos en el Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (“Manual

diagnóstico y estadístico de trastornos mentales”) , cuarta edición (DSM-IV-TR) (publicado por la Asociación Americana de Psiquiatría) , NINCDS-ADRDA, o MMSE.

13. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la enfermedad de Alzheimer es enfermedad de Alzheimer de aparición temprana que aparece en una persona por debajo de 65 años. 65


 

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