Alteraciones específicas de la enfermedad de Alzheimer de los niveles de proteína quinasa C épsilon (PKC-épsilon).

Procedimiento in vitro para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) determinar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto humano; y

b) comparar el nivel de PKC épsilon en dichas una o más células periféricas de dicho sujeto humano con el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto de control;

en el que dicho procedimiento es indicativo de la enfermedad de Alzheimer si el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de dicho sujeto humano es menor que el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de dicho sujeto de control.

Alteraciones específicas de la enfermedad de alzheimer de los niveles de proteína quinasa C epsilon (PKC-épsilon)

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de alteraciones en la proporción de los niveles de proteína PKC épsilon en una o más células periféricas en un paciente humano en comparación con los niveles de PKC épsilon en una o más células periféricas en un sujeto de control. Los biomarcadores moleculares específicos de la enfermedad de Alzheimer dados a conocer en la presente invención son útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y para procedimientos de cribado para la identificación de compuestos para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer. La presente invención da a conocer además procedimientos para elevar los niveles de proteína PKC épsilon que comprenden las etapas de poner en contacto una o más células periféricas humanas con una cantidad de un activador de PKC eficaz para elevar los niveles de PKC épsilon en comparación con una célula periférica humana no contactada.

TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad de Alzheimer (EA) , la forma más común de demencia, comienza con la pérdida de la memoria reciente y está asociada con dos características patológicas principales en el cerebro: placas amiloides extracelulares y ovillos neurofibrilares intracelulares. Estos están asociados típicamente con una importante pérdida de la sinapsis. Las placas amiloides están formadas por la agregación de oligómeros peptídicos ǹȕ que se generan a partir de la escisión de la proteína precursora de amiloide (APP) por la vía de la secretasa ȕ y secretasa Ȗ, mientras que la secretasa D genera la APP-Dno tóxica, sinaptogénica soluble. Observaciones acumuladas indican que los isoenzimas De isoenzima H de la proteína quinasa C (PKC) activan directamente la escisión de APP mediada directamente por la secretasa D (Slack y otros, 1993; Kinouchi y otros, 1995; Jolly-Tornetta y Wolf 2000; Yeon y otros, 2001, Lanni y otros, 2004) , y/o indirectamente a través de la fosforilación de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK1/2) (Devari y otros, 2006, Alkon y otros, 2007) . Muchas observaciones indican también que las vías de señalización de PKC regulan los eventos importantes en la fisiopatología neurodegenerativa de la EA, tales como la degradación de ǹȕ mediada por la enzima convertidora de endotelina (ECE) (Nelson y otros, 2009) . La sobreexpresión in vivo de PKCH en ratones transgénicos EA redujo las placas amiloides (Choi y otros, 2006) .Otros estudios han proporcionado pruebas de que anormalidades patológicas específicas de la EA se pueden encontrar en tejidos distintos al cerebro entre los que se incluyen sangre, fibroblastos de la piel y los tejidos oculares (Gurreiro y otros, 2007, Ray y otros, 2007) . En fibroblastos de la piel de EA, por ejemplo, se encontraron defectos de canales específicos de K+ (Etcheberrigaray y otros, 1993; 1994) , isoenzimas PKC (Govoni y otros, 1993, Favit y otros, 1998) , señalización de Ca+ (Ito y otros, 1994) , fosforilación de quinasa MAP Erkl/2 (Zhao y otros, 2002; Khan y Alkon, 2006) , y PP2A (Zhao y otros, 2003) . Para los pacientes de EA familiar, los fibroblastos de la piel mostraron una mayor secreción de ǹȕ (Citron y otros, 1994; Johnston y otros, 1994) mientras que se indujo una reducción específica de EA de canales específicos de K+ por ǹȕȚ-40 en fibroblastos humanos normales (Etcheberrigaray, y otros, 1993; 1994) . Recientemente, se ha demostrado que un biomarcador periférico fosforilado de Erkl/2 en fibroblastos de piel, confirmado por autopsia y controlado internamente, tiene una sensibilidad y especificidad prometedoras (Khan y Alkon, 2006; 2010) . Aún otros estudios han sugerido un déficit de la PKC en regiones particulares del cerebro de pacientes con EA (Masliah y otros, 1991) . Finalmente, se ha demostrado recientemente además que los activadores farmacológicos de PKC-D y PKCH pueden proteger dos cepas diferentes de ratones con EA de todas las características patológicas y anormalidades cognitivas de la EA (Hongpaisan y otros, 2011) . De forma consistente con estas observaciones, se encontró que PKC-D y PKCHse redujeron significativamente en los ratones transgénicos con EA y se restauraron a niveles normales mediante el tratamiento con activadores farmacológicos de PKC-D y PKCH (Hongpaisan y otros, 2011) . La publicación de Matsushima y otros, Journal of Neurochemistr y , julio de 1996, vol. 67, no. 1, páginas 317 a 323 hace referencia a estudios respecto a la actividad de la proteína quinasa C (PKC) en condiciones de ensayo de PKC dependiente de Ca2+ (actividad de PKC dependiente de Ca2+) y PKC independiente de Ca2+ (actividad de PKC independiente de Ca2+) en cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer (EA) y controles de la misma edad. Seung y otros, en Biochemical and Biophysical Research Communications 280, páginas 782-787, 2001, investiga el papel de PKC-H en el procesamiento de proteínas precursoras de amiloide (APP) APP utilizando células B103 que sobreexpresan APP. En el Journal of Biochemistr y (JB) Minireview, vol. 132, páginas 847-852, 2002, Yoshiko Akita analiza la estructura única y la función PKC-H. De Barr y y otros, en Experimental Gerontology, vol. 45, páginas 64 a 69 de 2010, estudian el papel de la PKC como un biomarcador periférico para la enfermedad de Alzheimer.

En conjunto, estos y otros estudios anteriores tienen dos implicaciones importantes: I. La EA tiene expresión patológica sistémica con consecuencias sintomáticas limitadas a la función cerebral, y II. Las isoenzimas PKC, en particular D y H, juegan un papel fundamental en la regulación de los aspectos principales de la patología de la EA, incluyendo la pérdida de sinapsis, la generación de placas ǹȕ y amiloides y la hiperfosforilación mediada por GSK-3E-de tau en ovillos neurofibrilares. Por estas razones los presentes inventores han analizado la PKCH en fibroblastos de piel de pacientes con EA, controles de la misma edad (AC) y con demencia no de EA (DNEA) en los niveles de estado estacionario. Este informe revela que la PKCH así como los cambios en estos niveles inducidos

por la aplicación de oligómeros ǹȕ solubles, pueden proporcionar una base para el diagnóstico de EA en los tejidos periféricos.

Existe una necesidad de pruebas muy sensibles y altamente específicas para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer y para cribar compuestos útiles en el tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer. Los presentes inventores han identificado, por primera vez, biomarcadores moleculares específicos únicos de la enfermedad de Alzheimer útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer de una manera muy sensible y altamente específica en comparación con las pruebas de diagnóstico conocidas previamente. De este modo, los biomarcadores moleculares específicos únicos de la enfermedad de Alzheimer dados a conocer en la presente memoria descriptiva sirven como base para procedimientos de diagnóstico, que tienen un grado de sensibilidad y especificidad elevados para la detección y diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Los biomarcadores moleculares específicos únicos de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención son útiles además en procedimientos de cribado para identificar compuestos que pueden ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer. Los presentes inventores han descubierto además procedimientos para elevar los niveles de proteína PKC épsilon en células periféricas de pacientes humanos.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que los niveles de PKC épsilon en una o más células periféricas en un sujeto humano son más bajos en sujetos con la enfermedad de Alzheimer (EA) que en controles de la misma edad (AC) . En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) determinar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de dicho sujeto humano; y b) comparar el nivel de PKC épsilon con el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas en un sujeto de control; en el que dicho procedimiento es indicativo de la enfermedad de Alzheimer si el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas en dicho sujeto humano es menor que el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas en dicho sujeto de control.

En ciertas realizaciones, dicho nivel de PKC épsilon es un nivel de proteína... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) determinar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto humano; y

b) comparar el nivel de PKC épsilon en dichas una o más células periféricas de dicho sujeto humano con el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto de control;

en el que dicho procedimiento es indicativo de la enfermedad de Alzheimer si el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de dicho sujeto humano es menor que el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de dicho sujeto de control.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho nivel de PKC épsilon es un nivel de proteína PKC épsilon o un nivel de actividad de PKC épsilon.

3.Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho sujeto de control no tiene la enfermedad de Alzheimer. 4.Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la ausencia de la enfermedad de Alzheimer está indicada si dicho nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de dicho sujeto humano es mayor o igual que el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de dicho sujeto de control.

5.Procedimiento in vitro para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas de: b) determinar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto humano; c) poner en contacto dicha una o más células de la etapa (a) con un agente que es un activador de PKC épsilon; d) determinar el nivel de PKC épsilon en dicha una o más células en la etapa (c) después de dicha puesta en

contacto en la etapa (c) ; en el que la enfermedad de Alzheimer se indica si el nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (d) es mayor que el nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (b) .

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que la ausencia de la enfermedad de Alzheimer se indica si dicho nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (d) es igual o menor que el nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (b) .

7. Procedimiento in vitro para determinar o monitorizarla progresión de la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas de:

a) determinar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto humano;

b) comparar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas en dicho sujeto humano con el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto de control; y

c) determinar o monitorizar dicha progresión de la enfermedad de Alzheimer basándose en dicha comparación en la etapa (b) .

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que dicho nivel de PKC épsilon es un nivel de proteína PKC épsilon o un nivel de actividad de PKC épsilon.

9. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que el nivel de PKC épsilon aumenta en una o más células periféricas de dicho sujeto humano a medida que la progresión de la enfermedad de Alzheimer se invierte.

10. Procedimiento in vitro para elevar el nivel de la proteína PKC épsilon en una célula, que comprende la etapa de poner en contacto una o más células periféricas humanas con una cantidad de un activador de PKC eficaz para elevar el nivel de proteína PKC épsilon en dichas células periféricas en comparación con una célula periférica humana no contactada.

11. Procedimiento in vitro de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas de: b) determinar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto humano; c) poner en contacto dicha una o más células periféricas de la etapa (a) con un péptido ǹȕ;

d) determinar el nivel de PKC épsilon en dicha una o más células periféricas en la etapa (c) después de dicha puesta en contacto de la etapa (c) ;

en el que la enfermedad de Alzheimer se indica si el nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (d) no es significativamente diferente del nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (b) .

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que la ausencia de la enfermedad de Alzheimer se indica si dicho nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (d) es menor que el nivel de PKC épsilon determinado en la 10 etapa (b) .

13. Procedimiento in vitro de identificación de un compuesto útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende:

b) determinar el nivel de PKC épsilon en una o más células periféricas de un sujeto con enfermedad de Alzheimer;

c) poner en contacto dichas células periféricas con un compuesto candidato;

d) determinar el nivel de PKC épsilon en dicha una o más células periféricas después de dicha etapa de contacto (c) ;

en el que dicho compuesto candidato se identifica como un compuesto útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer si el nivel de PKC épsilon determinado en la etapa (d) es mayor que el nivel de PKC épsilon determinada en la etapa (b) .