Método de ensayo con membranas.

Un método de ensayo con membranas para una muestra de sangre entera,

comprendiendo dicho método tratar dicha muestra en unas condiciones con las que causa una lisis de células, y someter la muestra lisada generada de este modo a unas condiciones que causan la disociación de moléculas de ácidos nucleicos, y hacer pasar la muestra a través de la membrana, en donde el tamaño de poros de dicha membrana no es mayor que 5 μm y en donde además un ligando de fijación específica para un componente de la muestra está inmovilizado sobre dicha membrana.

Método de ensayo con membranas El presente invento se refiere a unos métodos para mejorar la exactitud, la confiabilidad y/o la velocidad de unos ensayos realizados con muestras corporales. En particular, el presente invento se refiere a unos ensayos de alta velocidad realizados usando unas membranas o unos filtros con un pequeño tamaño de poros (p.ej. de menos que 1 µm) , especialmente con unas muestras que contienen células o desperdicios celulares. De modo sumamente particular, el presente invento se refiere a unos métodos para mejorar los ensayos de concentración con membranas mediados por una lisis (p.ej. una lisis con detergentes) y a unos correspondientes estuches y dispositivos de ensayo.

Unos ensayos de diagnóstico rápido son cada vez más importantes para su uso en el sitio de los cuidados (PoC, acrónimo de point of care – p.ej. en el momento de la consulta con un profesional médico) o en unos laboratorios de diagnóstico médico pequeños o de respuesta rápida. Dichos ensayos, especialmente, para el uso en el PoC emplean típicamente por lo menos un “dispositivo”, tal como un tubo desechable, un bastoncillo, un cartucho, un rotor, etc, que contiene unos volúmenes para recibir una o varias muestras más unas trayectorias de fluidos que permiten unas interacciones específicas de la muestra con ciertas partes del dispositivo, y/u otros reactivos. Las membranas, por ejemplo de nitrocelulosa, con un tamaño de poros relativamente pequeño, típicamente de 0, 2-5 µm, son un componente corrientemente usado para ensayos de diagnóstico rápido (p.ej. ensayos inmunológicos) . Dichas, membranas se pueden usar como la fase sólida del ensayo y se usan también para recoger micro partículas y materiales biológicos precipitados.

Hay dos enfoques generales que se pueden usar para el ensayo rápido de componentes en unas muestras que contienen células, tal como un ensayo de proteínas plasmáticas en la sangre; se puede o bien separar las células con respecto del fluido (p.ej. un plasma) o descomponer las células para que pasen a través de la membrana. En el método de separación, las células son retiradas o bien en un proceso realizando por separado antes de un análisis,

o por uso de un filtro en el dispositivo de ensayo propiamente dicho. En el método de descomposición de células, las membranas de las células (p.ej. células sanguíneas) son fragmentadas y típicamente solubilizadas, por ejemplo por uso de unos detergentes, permitiendo de esta manera que el material pase a través de los poros de la membrana.

Unos ensayos rápidos, particularmente para su uso en el sitio de los cuidados o en situaciones dinámicas de laboratorio, deberían ser limitados normalmente a un pequeño número de (preferiblemente una única) etapa (s) y a una duración de solamente unos pocos minutos. Esto hace impracticable el uso de una etapa de separación de células realizada por separado y significa que una separación de un fluido (p.ej. un plasma) o bien debe de tener lugar como una parte integrada de los sucesos dentro del dispositivo, o debe de hacer uso de unos agentes o unas condiciones de lisis, tales como unos detergentes, para descomponer y disolver las paredes de las células y las membranas nucleares con el fin de permitir que la muestra pase a través de los poros de la membrana del filtro. Especialmente con unos formatos de circulación a través de membranas para ensayos cuantitativos, el método de lisis es beneficioso, puesto que resulta difícil diseñar una eficiente separación de células sanguíneas con este formato.

En unos ensayos para usarse en el sitio de los cuidados, la velocidad, la sensibilidad y la exactitud son todas ellas unos factores altamente deseables, pero en el contexto del ensayo es frecuentemente necesario hacer un “cambalache”, sacrificando una posible mejoría en uno de los factores (tal como la sensibilidad) con el fin de proporcionar un rendimiento aceptable en otro de ellos (tales como la velocidad) . Tendría un gran valor el hecho de proporcionar un método mediante el cual estas propiedades pudieran ser mejoradas en común, de manera tal que el balance podría hacerse a un nivel de más alto rendimiento global.

Los formatos de ensayo de circulación a través de membranas, también denominados ensayos de concentración inmunológica, emplean unas membranas con un pequeño tamaño de poros, típicamente de 0, 45 µm, a las que se fijan unos restos de fijación específica, tales como anticuerpos, receptores, fragmentos de anticuerpos, etc. Este formato exige unas muestras altamente exentas de partículas, puesto que incluso unos pequeños números de partículas, por ejemplo de desperdicios celulares con unos tamaños situados alrededor del tamaño de poros de la membrana o que lo superen, disminuyen de una manera eficiente la circulación del líquido a través de la membrana. En el peor de los casos, esto puede conducir a una detención completa del transporte de líquido a través de la membrana, pero incluso una pequeña inhibición de la circulación a través de una membrana puede causar unos problemas de circulación y/o un deterioro en la confiabilidad de ensayo. Una cuestión crucial cuando se desarrollan ensayos de circulación a través de membranas es, por lo tanto, tratar a cualesquiera muestras que contengan células de una manera tal que ellas pasen a través de la membrana sin cambiar el tamaño efectivo de poros ni las propiedades de circulación de la membrana durante todo el ensayo.

Además de lo antedicho, la corrección del hematocrito es otro problema, que se plantea con los ensayos cuantitativos basados en una sangre entera, que puede ser abordado por uso de unos métodos de lisis (especialmente de lisis con detergentes) . Específicamente, usando una lisis de células, una simple medición de la hemoglobina del material lisado proporciona la posibilidad de una corrección del hematocrito.

Durante la lisis (especialmente la mediada por detergentes) de una sangre entera o de otras muestras que contengan células, la meta principal es la de descomponer las membranas celulares y las membranas de los núcleos de manera tal que se permita el paso a través del dispositivo, especialmente a través de un filtro o una membrana.

Por ejemplo, los detergentes invaden a las membranas y producen micelas y complejos de proteínas y detergentes. El tamaño de las micelas es generalmente lo bastante pequeño como para hacer que ellas pasen a través de una típica membrana con un tamaño de poros de 0, 45 µm. Similarmente, unos agentes de lisis caotrópicos descomponen a la estructura de las proteínas soportadas dentro de la membrana y de esta manera descomponen su estructura.

A pesar de las considerables ventajas del método de lisis (p.ej. con detergentes) en unos ensayos del tipo de membranas, muy pocos sistemas de ensayo comerciales usan este método, particularmente para sistemas de ensayo automáticos. Una razón de esto puede consistir en que un bloqueo de las membranas y una restricción de la circulación suceden algunas veces en unas circunstancias en las que se hubiera esperado una disolución completa de las membranas celulares para formar unas micelas. Con anterioridad, este comportamiento ha sido descartado como artificioso o simplemente no ha sido comprendido, puesto que se ha creído con anterioridad que el factor limitador para el transporte a través de membranas en unos ensayos de lisis es la descomposición de las membranas alrededor y dentro de las células de la muestra. En unas muestras de sangre, por ejemplo, se ha creído que una solubilización inadecuada de las membranas de las células o de las membranas de los núcleos de los leucocitos (glóbulos blancos) era la causa principal del bloqueo de las membranas.

Los presentes autores del invento han comprobado ahora inesperadamente, en contraste con el comportamiento anteriormente entendido de las muestras de células lisadas que un ácido nucleico celular, especialmente un ADN, incluso en muy pequeñas cantidades, puede causar un bloqueo determinante del caudal de las membranas y unas señales de fondo alto de ensayos.

En un primer aspecto, el presente invento proporciona por lo tanto un método de ensayo para una muestra de sangre entera, comprendiendo dicho método tratar a dicha muestra en unas condiciones con la que se cause una lisis de las células; y someter a la muestra lisada, generada de este modo, a unas condiciones que causan la disociación de moléculas de ácido nucleico, especialmente de moléculas de ADN. Las condiciones para causar la lisis de las células comprenden la adición de un agente de lisis de células, tal como un detergente. El método es un método de ensayo con membranas, más preferiblemente un método de ensayo de... [Seguir leyendo]

1. Un método de ensayo con membranas para una muestra de sangre entera, comprendiendo dicho método tratar dicha muestra en unas condiciones con las que causa una lisis de células, y someter la muestra lisada generada de este modo a unas condiciones que causan la disociación de moléculas de ácidos nucleicos, y hacer pasar la muestra a través de la membrana, en donde el tamaño de poros de dicha membrana no es mayor que 5 µm y en donde además un ligando de fijación específica para un componente de la muestra está inmovilizado sobre dicha membrana.

2. El método como se reivindica en la reivindicación 1 en donde la disociación de moléculas de ácidos nucleicos es proporcionada por unas condiciones físicas, unas condiciones radiativas, unas condiciones químicas y/o unas condiciones biológicas.

3. El método como se reivindica en la reivindicación 2 en donde dichas condiciones biológicas son proporcionadas por un reactivo biológico seleccionado entre una nucleasa de Micrococcus, una nucleasa S1, una nucleasa de haba de Mung, una DNase I, una nucleasa BAL 31 y una Benzonase™.

4. El método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3 en donde la lisis de células es una lisis con detergentes, una lisis hipotónica, una lisis hipertónica o una lisis caotrópica.

5. El método como se reivindica en la reivindicación 4 en donde dicha lisis es proporcionada por un detergente seleccionado entre agentes tensioactivos catiónicos, agentes tensioactivos aniónicos, agentes tensioactivos iónicos híbridos y agentes tensioactivos no iónicos.

6. Un uso de una nucleasa en aumentar el rendimiento de un método de ensayo que comprende la circulación de una muestra de sangre entera lisada a través de una membrana con un tamaño de poros no mayor que 5 µm, que tiene inmovilizado sobre ella un ligando de fijación específica para un componente de la muestra proporcionando unas condiciones de disociación de ácidos nucleicos a la muestra de sangre entera lisada.

7. El uso como se reivindica en la reivindicación 6 en un método tal como se expone en una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5.

8. El uso como se reivindica en la reivindicación 6 o en la reivindicación 7 para conseguir por lo menos uno de los siguientes mejoramientos:

a) reducir el bloqueo de la membrana,

b) reducir el período de tiempo de ensayo c) aumentar el volumen de la muestra que se puede tratar.

9. Un dispositivo de ensayo para el ensayo de la proteína reactiva C, de cobalamina, de transcobalamina, de holotranscobalamina, de homocisteína, de un folato, y de sus combinaciones, que comprende una cámara para recibir sangre entera y por lo menos una membrana con un tamaño de poros no mayor que 5 µm, que tiene inmovilizado sobre ella un ligando de fijación específica para un componente de la muestra, seleccionado entre la proteína reactiva C, la cobalamina, la transcobalamina, la holo-transcobalamina, la homocisteína, un folato y sus combinaciones, en donde dicho dispositivo contiene unos reactivos químicos y/o biológicos para causar una disociación de ácidos nucleicos y en donde dicho dispositivo es apropiado para usarse en o con un equipo de análisis automático en el “sitio de los cuidados”.

10. El dispositivo como se reivindica en la reivindicación 9 en donde dicho dispositivo contiene una nucleasa.

11. El dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 en donde dicho dispositivo contiene un detergente.

12. Un estuche para el ensayo de una proteína reactiva C, de cobalamina, de transcobalamina, de holotranscobalamina, de homocisteína, de un folato, y de sus combinaciones en una sangre entera, comprendiendo dicho estuche: una membrana con un tamaño de poros de no más que 5 µm, que tiene inmovilizado sobre ella un ligando de fijación específica para un componente de la muestra seleccionado entre la proteína reactiva C, la cobalamina, la transcobalamina, la holo-transcobalamina, la homocisteína, un folato y sus combinaciones; y por lo menos unos medios químicos y/o biológicos para la disociación de ácidos nucleicos.

13. El estuche como se reivindica en la reivindicación 12 que comprende un dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 11.