PAREJAS DE UNION ESPECIFICA DE HOLO-TRANSCOBALAMINAS Y SU USO EN EL ENSAYO DE LA COBALAMINA.

Un método para identificar parejas de unión específica para la holoTC,

que tengan una mayor especificidad para la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, que comprende seleccionar un banco de ligantes específicos potenciales con al menos un péptido cíclico que comprende el motivo

SX1 X2YX3 WD X4 X5 X6

en el que:

X1 = F, G, L

X2 = F, L, R

X3 = L, P, Q

X4 = M, Q, Y

X5 = D, F

X6 = M, R

o el motivo SFFYSLCYCW, sus construcciones, o construcciones de al menos una de las regiones I a III de la TC humana como se define a continuación:

I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269

II) Ile 161 a Val 243

III) Arg 271 a Asp 297;

en el que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo

Parejas de unión específica de holo-transcobalaminas y su uso en el ensayo de la cobalamina.

La presente invención se refiere a un método para ensayar la holotranscobalamina (holoTC) en muestras de origen biológico, en especial de mamífero, y a parejas de unión específica ("specific binding partners", sbp) para la transcobalamina (TC) para su uso en dichos ensayos, así como a su producción.

La holoTC es el complejo entre la cobalamina y su proteína transportadora sérica transcobalamina.

La cobalamina o vitamina B₁₂ es un vitamina hidrosoluble que forma parte del complejo de la vitamina B que se encuentra en los alimentos. La molécula central consiste en un anillo de corrina de cuatro unidades pirrol que rodean a un átomo de cobalto. La cobalamina es la única vitamina que no puede ser sintetizada por los animales y debe ser absorbida desde los alimentos en el intestino. Es sintetizada por microorganismos, en particular por bacterias anaerobias y levaduras.

La cobalamina actúa in vivo como coenzima, y se sabe que las enzimas de cobalamina catalizan tres tipos de reacciones: (1) redisposiciones intramoleculares, por ejemplo la formación de succinil CoA a partir de L-metilmalonil CoA; (ii) metilaciones, por ejemplo la formación de metionina mediante la metilación de la homocisteína; y (iii) la reducción de ribonucleótidos para producir desoxirribonucleótidos en algunos microorganismos. También se cree que la deficiencia en cobalamina puede alterar la regulación de las citoquinas y del factor del crecimiento (véase Miller, Nutrition Review, 60:142-144 (2002), y Scalabrino et al., J. Neuroimmunology, 127:37-42 (2002)).

En el proceso de la digestión, la cobalamina, liberada de los alimentos mediante su cocinado o mediante el entorno ácido del estómago, es unida por una proteína salivar denominada haptocorrina, en lo sucesivo denominada HC (pero en la técnica también se denomina R-ligante o transcobalamina I y II colectivamente), para formar un complejo. Las enzimas pancreáticas digieren el complejo de cobalamina-haptocorrina, la holohaptocorrina (holoHC), en el íleon, liberando cobalamina que entonces se une a una proteína denominada factor intrínseco, que es segregada por la mucosa gástrica, para formar otro complejo. El complejo de cobalamina-factor intrínseco se une a un receptor específico en el revestimiento del íleon terminal, tras lo cual es disociado por un factor de liberación y la cobalamina es transportada activamente a través de la membrana del íleon y se secreta hacia la corriente sanguínea unida a su proteína transportadora transcobalamina (TC).

Debe reconocerse que la TC se ha denominado en el pasado transcobalamina II (TCII). En la presente se utiliza TC, apoTC y holoTC para indicar TCII, apo-TCII y holo-TCII, respectivamente.

La cobalamina no circula en la sangre en forma libre en ninguna cantidad apreciable. Aproximadamente 99% de la cobalamina es unida por uno de HC, TC y albúmina.

La proteína responsable de transportar la cobalamina hacia los tejidos diana es la TC. La TC es una proteína traza fundamental sin la cual la cobalamina no puede atravesar las membranas celulares. A pesar de esta importante función metabólica, sólo aproximadamente 6-25% de la cobalamina en el suero está unida a TC y la mayoría es portada por HC. La TC es un polipéptido de una única cadena de 45 kDa que se encuentra principalmente en el suero, el fluido seminal y el fluido cerebroespinal. La cobalamina unida a TC (holo-TC) se une a receptores específicos sobre las membranas celulares y, una vez unida, el complejo de holo-TC se introduce en las células mediante pinocitosis.

La TC es sintetizada por el hígado, el endotelio vascular, los enterocitos, los macrófagos y los fibroblastos, y circula predominantemente como apo-TC, es decir, sin cobalamina unida. Tiene una semivida corta de aproximadamente 90 minutos.

Se cree que la secuencia de aminoácidos de la TC humana es la siguiente:

Los primeros 18 aminoácidos, que aparecen en cursiva, son una secuencia conductora que no se encuentra en la proteína madura que circula en la sangre. Además, existe un serie de polimorfismos conocidos, de los cuales la sustitución de la arginina, en lugar de la prolina, en la posición 259 (que aparece en negrita) (SEQ ID NO:2) es el más habitual y es igualmente abundante que la secuencia mostrada. Otros polimorfismos descritos son M198T, I219L, Q234R y S376L.

Puesto que la cobalamina debe absorberse de los alimentos, cualquier trastorno que produzca una función gástrica mermada, por ejemplo la gastroenteritis, o trastornos que produzcan atrofia gástrica, o una incapacidad para producir haptocorrina funcional, factor intrínseco, factor de liberación, TC o receptores de TC puede dar como resultado una captación mermada de cobalamina y su deficiencia resultante.

Ciertos subgrupos de población, por ejemplo los ancianos, las mujeres embarazadas, los pacientes con enfermedad gastrointestinal crónica o aguda, los que padecen ciertas enfermedades autoinmunológicas, los que tienen una historia familiar de anemia perniciosa, y los que padecen SIDA, son particularmente propensos a una deficiencia en cobalamina.

Las manifestaciones clínicas de la deficiencia en cobalamina son variadas y numerosas, pero principalmente implican anemia, hematopoyesis megaloblástica y trastornos funcionales y estructurales del sistema nervioso. Aproximadamente 60% de los individuos diagnosticados como deficientes en cobalamina son anémicos, pero en muchos, los síntomas neurológicos son las únicas señales clínicas observadas. Aproximadamente 10% de los pacientes muestran síntomas psiquiátricos y aproximadamente 40% muestran síntomas neurológicos y psiquiátricos.

El diagnóstico temprano de la deficiencia en cobalamina es fundamental para asegurar una buena prognosis para los pacientes, puesto que algunas de las manifestaciones de la deficiencia en cobalamina, en particular los efectos neuropsiquiátricos, son irreversibles si no se detectan y se alivian rápidamente con una terapia con cobalamina.

Por tanto, resulta deseable evaluar de forma precisa el nivel de cobalamina de un individuo de una manera conveniente y eficaz, para establecer si el individuo puede o no estar sufriendo una deficiencia en cobalamina. Puesto que la TC es la responsable de transportar la cobalamina hacia el interior de las células, el contenido en holoTC de una muestra corporal proporciona un mejor indicador de la deficiencia en cobalamina que el contenido total en cobalamina.

Debido a que la holoTC está presente en fluidos corporales en concentraciones tan bajas, los métodos de ensayo previos no han sido en general totalmente satisfactorios. Un paciente con un nivel sérico en holoTCII en el extremo más bajo del intervalo normal tiene, de forma típica, una concentración sérica de holoTCII de aproximadamente 30 x 10^-12 M, y los ensayos convencionales basados en la absorción física de TC sobre un sustrato sólido, por ejemplo sílice, tienen un límite inferior de detección de aproximadamente 40 x 10^-12 M. Por tanto, estos ensayos tienen un valor relativamente bajo para la evaluación de la deficiencia en holo-TCII (véase Wickramasinghe et al., J. Clin. Path., 49:755-758 (1996)).

En el documento WO00/17659, se propuso emplear parejas de unión específica (sbp) para TCII u holo-TCII en un método de ensayo para la holo-TCII, proporcionando con ello un método de ensayo de holo-TCII que puede adaptarse con más facilidad a su automatización y a los requisitos de un laboratorio analítico con alta capacidad de procesamiento.

Los inventores han descubierto ahora un epitopo concreto de la holoTC para el cual pueden generarse sbp que presenten una excelente discriminación entre apoTC y holoTC. Además, mediante la creación de un "mimotopo" de péptido cíclico que imita al epitopo de holoTC, también se pueden producir sbp que permiten obtener un método de ensayo para holoTCII que sea muy susceptible a su automatización y a su uso en ensayos de alta capacidad de procesamiento.

Para métodos de ensayo que puedan adaptarse con facilidad a las principales plataformas automáticas, por ejemplo Centaur® (Bayer, Alemania), Elecsys® (Roche), o Axysm® (Abbott), son necesarios sbp para holoTC. Sin embargo, aún no se han descrito sbp que discriminen entre apoTC y holoTC, necesarios para estos formatos...

1. Un método para identificar parejas de unión específica para la holoTC, que tengan una mayor especificidad para la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, que comprende seleccionar un banco de ligantes específicos potenciales con al menos un péptido cíclico que comprende el motivo

SX₁ X₂YX₃ WD X₄ X₅ X₆

en el que:

X₁ = F, G, L

X₂ = F, L, R

X₃ = L, P, Q

X₄ = M, Q, Y

X₅ = D, F

X₆ = M, R

o el motivo SFFYSLCYCW, sus construcciones, o construcciones de al menos una de las regiones I a III de la TC humana como se define a continuación:

I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269

II) Ile 161 a Val 243

III) Arg 271 a Asp 297;

en el que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dichos péptidos cíclicos son presentados sobre la superficie de fagos.

3. Una pareja de unión específica que puede obtenerse mediante el método de la reivindicación 1 que tiene una especificidad mayor por la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, en la que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo, que también tiene afinidad por al menos uno de los motivos o regiones especificados en la reivindicación 1.

4. Una pareja de unión específica para la holoTC, que tiene una mayor especificidad para la holoTC frente a la apoTC al menos en 40 veces, en la que dicha pareja de unión específica es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo, que también tiene afinidad por al menos un péptido cíclico que comprende el motivo

SX₁ X₂YX₃ WD X₄ X₅ X₆

en el que:

X₁ = F, G, L

X₂ = F, L, R

X₃ = L, P, Q

X₄ = M, Q, Y

X₅ = D, F

X₆ = M, R

o el motivo SFFYSLCYCW, o que se une al menos a una de las regiones I, II o III de la TC;

I) Leu 39 a Lys 77, y Thr 265 a Lys 269

II) Ile 161 a Val 243

III) Arg 271 a Asp 297.

5. Una pareja de unión específica para la holo TC según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que dichos péptidos cíclicos son presentados sobre la superficie de fagos.

6. Una pareja de unión específica para la holoTC según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la que la unión de dicha pareja de unión específica a la holoTC es bloqueada por la unión de una pareja de unión específica que tiene afinidad por un sitio presente sobre holoTC y apoTC que se solapa con el sitio de unión sobre holoTC de dicha pareja de unión específica para la holoTC.

7. Una pareja de unión específica según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que la pareja de unión específica es el anticuerpo 3C4 depositado en the European Collection of Cell Cultures con el nº de registro 02110741.

8. Una pareja de unión específica según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que la pareja de unión específica es un anticuerpo monocatenario con la secuencia de aminoácidos:

o su anticuerpo monocatenario madurado para la afinidad.

9. Un método de ensayo para ensayar la holoTC en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con una pareja de unión específica para la holoTC y detectar los conjugados resultantes de holoTC y la pareja de unión específica, en el que dicha pareja de unión específica es según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que dichos conjugados de holoTC y la pareja de unión específica se detectan directamente mediante una propiedad del conjugado.

11. Un método según la reivindicación 9, en el que dichos conjugados de holoTC y la pareja de unión específica se detectan indirectamente detectando otros conjugados formados en competición, o detectando un conjugado de la pareja de unión específica, la holoTC y otro ligando.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha pareja de unión específica para la holoTC está inmovilizada o es inmovilizable, y se emplea para capturar la holoTC.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha pareja de unión específica para la holoTC se emplea para detectar la holoTC que está capturada por un ligando secundario inmovilizado o inmovilizable.

14. Un método de ensayo para la holoTC según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende el uso de un mimotopo de péptido constreñido que comprende el motivo

SX₁ X₂YX₃ WD X₄ X₅ X₆

en el que:

X₁ = F, G, L

X₂ = F, L, R

X₃ = L, P, Q

X₄ = M, Q, Y

X₅ = D, F

X₆ = M, R

o el motivo

SFFYSLCYCW

o una construcción de dos o más de dichos mimotopos.

15. Un método según la reivindicación 14, en el que dicho mimotopo es presentado sobre la superficie de fagos.

16. Un método según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que dicho mimotopo se utiliza como competidor para la holoTC en la unión a dicha pareja de unión específica para la holoTC.

17. Un método según la reivindicación 9, que comprende:

i) poner en contacto una muestra líquida procedente de un sujeto, con una pareja de unión específica (sbp) para la holoTC inmovilizada o inmovilizable para formar un conjugado de holoTC:sbp,

ii) poner en contacto la pareja de unión específica con un ligando secundario para TC u holoTC de forma que el ligando secundario se une a la holoTC unida para formar un conjugado de sbp:holoTC:ligando secundario,

iii) separar el ligando secundario no unido del conjugado de sbp:holoTC:ligando secundario,

iv) opcionalmente liberar el conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario de estar inmovilizado y/o liberar un holoTC:ligando secundario de la sbp,

v) opcionalmente añadir un cosustrato o ligando terciario para facilitar la detección del conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario o del conjugado de holoTC:ligando secundario,

vi) detectar el conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario o un conjugado de holoTC:ligando secundario, y

vii) relacionar la cantidad detectada de conjugado de holoTC:sbp:ligando secundario o de conjugado de holoTC:ligando secundario con la concentración de holoTC en la muestra líquida para proporcionar una medición de la holoTC presente en la muestra líquida.

18. Un método según la reivindicación 17, que comprende además relacionar la concentración de la holoTC presente en la muestra líquida con la presencia o la ausencia de una deficiencia en cobalamina en el sujeto.

19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, que comprende además medir la apoTC o la TC total.

20. Un método para inducir anticuerpos específicos de la holoTC humana en un sujeto no mamífero, que comprende administrar una sustancia inmunogénica que comprende un motivo como se define en la reivindicación 4, o que comprende al menos una de las regiones I a III como se define en la reivindicación 4, a dicho sujeto.

21. Un kit para su uso en un método de ensayo según las reivindicaciones 9 a 19, comprendiendo dicho kit una pareja de unión específica para la holoTC, opcionalmente marcada o inmovilizada, según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

22. Un kit según la reivindicación 21, en el que dicha pareja de unión específica es como se define en la reivindicación 7 o la reivindicación 8.

23. Un kit según la reivindicación 21 o la reivindicación 22, que comprende además un ligando de unión a TC opcionalmente marcado o inmovilizado.

24. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, que comprende además una pluralidad de disoluciones de holoTC de concentración conocida.

25. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, que comprende además instrucciones para la realización de dicho método de ensayo.

26. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, que comprende además una pluralidad de disoluciones de apoTC de concentración conocida.