Ensayo de homocisteína.

SE SUMINISTRA UN METODO PARA COMPROBAR LA HOMOCISTEINA EN UNA MUESTRA POR EJEMPLO SANGRE,

PLASMA U ORINA, QUE COMPRENDE LOS PASOS DE PONER EN CONTACTO CON LA MUESTRA CON UNA ENZIMA DE CONVERSION DE LA HOMOCISTEINA DIFERENTE DE LA SAH-HIDROLASA Y AL MENOS UN SUBSTRATO PARA LA ENZIMA DIFERENTE DE LA HOMOCISTEINA Y SIN SEPARACION CROMATOGRAFICA COMPROBAR LA PRESENCIA DE UNA SUBSTANCIA NO ETIQUETADA SELECCIONADA ENTRE UN CO-SUBSTRATO DE HOMOCISTEINA Y LOS PRODUCTOS DE CONVERSION DE LA HOMOCISTEINA DE LA CONVERSION ENZIMATICA DE LA HOMOCISTEINA MEDIANTE LA ENZIMA.

Ensayo de homocisteína.

La presente invención se refiere a un ensayo para determinar homocisteína en muestras clínicas.

La homocisteína es un aminoácido intermedio producido cuando la metionina es metabolizada a cisteína. Generalmente, la homocisteína producida en el organismo es metabolizada rápidamente mediante una de dos rutas, (1) condensación con serina para formar cistation o (2) conversión a metionina, y su concentración (y la de su forma oxidada homocistina) en el organismo vivo bajo condiciones normales es virtualmente despreciable.

Los niveles de homocisteína en muestras biológicas pueden tener sin embargo un significado clínico en varias situaciones, ya que la homocisteína juega una parte importante en el conjunto complejo de rutas que constituyen el metabolismo de los sulfhidril aminoácidos y su acumulación puede ser indicativa de diferentes trastornos que tienen lugar en estas rutas, incluyendo en particular errores innatos del metabolismo. Así, por ejemplo, se sabe que la homocistinuria (un aumento anormal de homocisteína en la orina) es un trastorno del metabolismo de aminoácidos que resulta de deficiencias en los enzimas cistationina º-sintetasa o metiltransferasa del ácido metiltetrahidrofólico (que cataliza la metilación de homocisteína a metionina) .

El metabolismo de los sulfhidril aminoácidos está estrechamente ligado al del ácido fólico y al de la vitamina B12 (cobalamina) , que actúan como sustratos o cofactores en las diferentes transformaciones implicadas. Por esta razón, se ha propuesto también la acumulación de homocisteína como un indicador del mal funcionamiento de los enzimas dependientes de cobalamina o folato, o de otros trastornos o enfermedades relacionados con el metabolismo de la cobalamina o del folato.

Además, como la conversión de homocisteína en metionina se basa en una reacción que requiere 5-metil tetrahidrofolato como donante de metilo, el metabolismo de la homocisteína puede ser afectado también por fármacos anti-folato, tales como metotrexato, administrados para combatir otros trastornos, principalmente cáncer. La monitorización de homocisteína ha sido también propuesta, por tanto, para dirigir el tratamiento de enfermedades malignas con fármacos anti-folato.

Más recientemente, niveles elevados de homocisteína en sangre han sido correlacionados con el desarrollo de ateroesclerosis (ver Clarke y col., New Eng. J. Med. 324:1149-1155 (1991) ) e incluso una moderada homocisteinemia es considerada actualmente como un factor de riesgo para enfermedades cardíacas y vasculares. La medida de los niveles de homocisteína en plasma o en sangre tiene por tanto también importancia en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades vasculares.

Aunque no están disponibles métodos inmunológicos para determinar directamente homocisteína, ya que no hay ningún anticuerpo hacia homocisteína disponible, se han propuesto otros métodos diferentes para determinar homocisteína en muestras clínicas. Todos éstos implican separaciones cromatográficas y se han basado generalmente en uno de los tres principios siguientes: (1) análisis cromatográfico clásico de aminoácidos, (2) reacción de la homocisteína de la muestra con el enzima S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa en presencia del cosustrato S-adenosina marcado radioactivamente o de otro modo, seguido por separación y cuantificación del producto formado (S-adenosil-L-homocisteína, SAH) . Generalmente se utiliza separación cromatográfica (HPLC o TLC) y medidas de radioactividad (ver Refsum y col., Clin. Chem. 31:624-628 (1985) ; Kredich y col., Anal. Biochem. 116:503-510 (1981) ; Chui, Am. J. Clin. Path. 90 (4) :446-449 (1988) ; Totani y col., Biochem. Soc. 14 (6) :1172-9 (1988) y Schimizu y col., Biotechnol. Appl. Biochem. 8:153-159 (1986) ) , (3) reacción de la homocisteína de la muestra con un fluoróforo, seguido por separación mediante HPLC y fluorometría (ver Refsum y col., Clin. Chem. 35 (9) :1921-1927 (1989) ) .

Estos métodos requieren mucho tiempo para ser realizados, son tediosos y se basan todos en la cuantificación directa. Más particularmente, la separación cromatográfica es una característica común de los métodos de la técnica anterior y requiere un equipamiento altamente especializado y sofisticado.

La utilización de tal equipamiento no es generalmente bien aceptada en la práctica rutinaria de los laboratorios clínicos y, por consiguiente, tales procesos no son generalmente susceptibles de ser automatizados en los procedimientos de los laboratorios clínicos típicos.

While Tanaka et al., Enzyme Microb Technol, 7: 530-537 (1985) sugieren que la homocisteína puede ensayarse para el uso de gamma-liasa metionina.

Existe por tanto la necesidad de un ensayo mejorado para determinar homocisteína que sea sencillo, específico, rápido de realizar, fácilmente adaptable para ser utilizado en laboratorios clínicos y, sobre todo, que evite la necesidad de la costosa y larga separación cromatográfica. La presente invención trata de proporcionar tal ensayo.

En un aspecto, por tanto, la presente invención proporciona un método para analizar homocisteína en una muestra clínica, comprendiendo dicho método las etapas de poner en contacto la muestra con un enzima convertidor de homocisteína seleccionada del grupo formado por cistationina -sintetasa, metionina sintasa o betaína-homocisteínametiltransferasa, , y al menos un sustrato de dicho enzima distinto de homocisteína, y sin separación cromatográfica (esto es de reactivos o de los productos de reacción) , determinando (preferiblemente fotométricamente) un analito no marcado seleccionado del cosustrato de homocisteína y de los productos de la conversión enzimática de homocisteína por dicho enzima, siendo dicho cosustrato un compuesto que reacciona con homocisteína en la reacción de conversión de homocisteína catalizada por dicho enzima convertidor de homocisteína.

Después de poner en contacto la muestra con el enzima convertidor de homocisteína y el sustrato, se incuba preferiblemente durante al menos 30 segundos, especialmente al menos 5 minutos antes de realizar las etapas posteriores del ensayo.

El enzima convertidor de homocisteína utilizado en el ensayo de la invención no es la SAH-hidrolasa, sino las otras enzimas de la reivindicación 1. Así, puede hacerse mención, por ejemplo, de la betaína-homocisteína metil transferasa y de otros enzimas implicados en las conversiones de homocisteína (según está descrito, por ejemplo, por Graham en Trends Cardiovasc. Med. 1:244-249 (1991) ) .

El cosustrato de homocisteína determinado en el método de la invención es un compuesto que reacciona con la homocisteína en la reacción de conversión de homocisteína catalizada por el enzima.

Según se utiliza en la presente, el término "determinar" tiene la intención de incluir la determinación cuantitativa y cualitativa, en el sentido de obtener un valor absoluto de la cantidad o concentración del analito, por ejemplo el cosustrato de homocisteína, presente en la muestra, y de obtener también un índice, una proporción, un porcentaje, un valor visual u otro valor indicativo del nivel del analito en la muestra. La determinación puede ser directa o indirecta y la especie química detectada realmente no necesita ser, por supuesto, el propio analito sino que puede ser, por ejemplo, un derivado del mismo o alguna sustancia adicional, según se discute más adelante.

El ensayo de la invención utiliza convenientemente técnicas enzimáticas o inmunológicas para la determinación del analito. En una técnica enzimática preferida, el analito es puesto en contacto con un enzima adicional para el que es un sustrato y se determina un cosustrato o un producto de reacción directo o indirecto de la conversión enzimática del analito por ese enzima adicional. En una técnica inmunológica preferida, el analito es determinado utilizando un procedimiento que implica la unión competitiva a un anticuerpo del analito y un hapteno adicional (por ejemplo un polihapteno o un análogo marcado del analito) y la determinación del hapteno unido o no unido.

La cantidad de homocisteína en una muestra influye por tanto indirectamente sobre la formación o el consumo del cosustrato de homocisteína y, de este modo, sobre su concentración resultante en la mezcla de reacción. En esta invención, la concentración resultante o el cambio en la concentración del cosustrato de homocisteína en la mezcla de reacción puede ser utilizada como... [Seguir leyendo]

1. Un método para analizar homocisteína en una muestra clinica, comprendiendo dicho método las etapas de puesta homocisteína en contacto de dicha muestra con un enzima corvertidor de homocisteína, seleccionada del grupo formado por cistationina º-sintetasa, metionina sintasa o betaína-homocisteína-metiltransferasa, y al menos un cosustrato para dicho enzima distinto de homocisteína y, sin separación cromatográfica, la determinación de un analito no marcado seleccionado de dicho cosustrato y los productos de conversión de la homocisteína procedentes de la conversión enzimática de homocisteína por dicho enzima, siendo dicho cosustrato un compuesto que reacciona con homocisteína en la reacción de conversión de homocisteína catalizada por dicho enzima convertidor de homocisteína.

2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicha muestra es puesta en contacto con un anticuerpo hacia dicho analito y con un hapteno para dicho anticuerpo distinto de dicho analito no marcado, y en el que la determinación de dicho analito se efectúa indirectamente determinando dicho hapteno unido o no unido a dicho anticuerpo.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 2, en el que dicho hapteno es un polihapteno.

4. Un método como el reivindicado en la reivindicación 2, en el que dicho hapteno es una molécula marcada que tiene una unidad estructural epitópica que está presente también en dicho analito no marcado.

5. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo unido a una matriz portadora.

7. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicha muestra es puesta en contacto con un segundo enzima que sirve para convertir dicho analito y la determinación de dicho analito es efectuada indirectamente mediante la determinación de un sustrato de dicho segundo enzima distinto de dicho analito o mediante la determinación de un producto de la conversión enzimática de dicho analito por dicho segundo enzima.

8. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho analito es dicho cosustrato.

9. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho analito es dicho producto de conversión.

10. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha muestra es una muestra de sangre, plasma u orina pretratada con un agente reductor.

11. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la determinación de dicho analito es efectuada fotométricamente.

12. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11, en el que dicha determinación es efectuada espectrométricamente o colorimétricamente.

13. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11, en el que dicha determinación es efectuada turbidimétricamente o nefelométricamente.

14. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11, en el que dicha determinación es efectuada utilizando detección de polarización de fluorescencia.

15. Un método como el reivindicado en la reivindicación 3, en el que la determinación es efectuada determinando la precipitación o la aglutinación de conjugados anticuerpo:polihapteno.

16. Un kit analítico para ser utilizado en el ensayo para determinar la cantidad o concentración de homocisteína en una muestra, directamente o indirectamente, conteniendo dicho kit: un enzima convertidor de homocisteína seleccionado del grupo que consta de cistationina -sintetasa, metionina sintasa o betaína-homocisteína-metiltransferasa; un cosustrato para dicho enzima distinto de homocisteína, siendo dicho cosustrato un compuesto que reacciona con homocisteína en la reacción de conversión de homocisteína catalizada por dicho enzima convertidor de homocisteína; un agente productor de una señal y, opcionalmente, un medio para determinar la señal.