Método de elaboración utilizando proteasas fúngicas o bacterianas.

Método de elaboración de una cerveza que comprende la adición de una proteasa termoestable a un mosto después del filtrado pero antes del hervido del mosto,

donde termoestable significa que la actividad de la proteasa es al menos el 70% de la actividad de referencia cuando es evaluada según el siguiente método:

La proteasa es diluida a 1mg/ml en un tampón de ensayo que comprende 100 mM ácido succínico, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl2, 150 mM KCL, 0.01% Tritón X-100, pH ajustado a 5.5 con NaOH. La proteasa es entonces preincubada en i) hielo, ii) 10 min a 70°C. El sustrato para el que la proteasa tiene actividad es suspendido en 0.01% Tritón X-100. Para iniciar la reacción, se añaden 20 μl al tubo y se incuba en un termomezclador Eppendorf a 70°C, 1400 r.p.m. durante 15 min. La reacción se detiene colocando los tubos en hielo. Las muestras son centrifugadas en frío a 14000 g durante 3 min, y se mide el OD590 en el sobrenadante. El valor OD590 de las muestras en blanco es sustraído de los valores correspondientes de las muestras tratadas con proteasa. La termoestabilidad de la proteasa se determina calculando la actividad porcentual de las muestras preincubadas a 70° en comparación con la actividad de referencia, que es la actividad de la proteasa de las muestras incubadas en hielo.

Método de elaboración utilizando proteasas fúngicas o bacterianas Campo de la invención

[1] Esta solicitud se refiere a un método de elaboración donde se usa una proteasa termoestable para el control de la estabilidad coloidal de bebidas. Las proteasas pueden ser obtenidas a partir de Nocardiopsis, Badllus, o Thermoascus. La proteasa se añade bien a la malta remojada durante el filtrado y/o al mosto después del filtrado pero antes del hervido del mosto.

Antecedentes de la invención

[2] Muchas bebidas como la cerveza, el vino, el zumo, etc. desarrollan precipitados durante la producción o tras el almacenamiento. Este fenómeno se describe como fomnación de neblina. Generalmente se cree que la formación de neblina se debe a la interacción de proteínas y polifenoles presentes en la bebida. Esta interacción lleva a la formación de suspensión insoluble o semi-soluble de partículas coloidales. Ya que la formación de la neblina se asemeja generalmente a la nebulosidad producida por contaminación microbiana, se prefiere generalmente que las bebidas, particularmente la cerveza, sean muy claras y transparentes incluso tras un largo almacenamiento. Por lo tanto se han desarrollado procesos para reducir tal formación de neblina. Estos procesos van dirigidos a las proteínas o los polifenoles o ambos.

[3] Geles de sílice, bentonita, polivinilpolipirrolidona (PVPP), etc. se han usado para adsorber proteínas y polifenoles, reduciendo la formación de neblina y mejorando la estabilidad coloidal. No obstante tales materiales, cuando son usados reiteradamente, resultan en una disminución de las ganancias y consecuentemente llevan a costes aumentados. Además, también eliminan otros compuestos deseables de la bebida, lo cual puede afectara su

calidad.

[4] Las enzimas, particularmente las proteasas, también se usan durante la fermentación para mejorar la estabilidad coloidal de bebidas, particularmente cerveza. Generalmente, se han usado proteasas como papaína y bromelaína para reducir la formación de neblina fría. No obstante estas proteasas no son específicas y se ha demostrado que afectan a la estabilidad de la espuma de la bebida hidrolizando las proteínas responsables de la formación de la espuma. Además éstas también causan cambios de sabor en la bebida. Otra realización ha sido usando proteasas específicas que hidrolizan sólo las proteínas que forman neblina hidrofílica pero no las proteínas que forman espuma hidrofóbica. Por ejemplo, se conoce una endoproteasa de prolil específica que específicamente hidroliza las proteínas que forman la neblina mejorando así la estabilidad coloidal y reteniendo la estabilidad de la espuma. El uso de proteasas durante la fermentación puede retener su actividad en la cerveza final, lo cual es generalmente indeseable. La inactivación por pasteurización puede además llevar a un sabor a quemado en la cerveza.

[5] Todavía existe una necesidad de procesos mejorados para la estabilización coloidal de bebidas, especialmente cerveza.

Resumen de la invención

[6] En un aspecto, la invención se refiere a un método de elaboración de una cerveza que comprende:

[7] Un método de elaboración de una cerveza que comprende añadir una proteasa temnoestable a un mosto después del filtrado pero antes del hervido del mosto, donde termoestable significa que la actividad de la proteasa es al menos el 7% de la actividad de referencia cuando es evaluada según el siguiente método: se diluye la proteasa a 1mg/ml en un tampón de ensayo que comprende 1 mM ácido succínico, 1 mM HEPES, 1 mM CHES, 1 mM CABS, 1 mM CaCh, 15 mM KCL,.1% Tritón X-1, pH ajustado a 5.5 con NaOH. La proteasa es posteriormente preincubada en i) hielo, ii) 1 min a 7°C. El sustrato para el que la proteasa tiene actividad se suspende en.1% Tritón X-1. Para iniciar la reacción, se añaden 2 pl al tubo y se incuban en un termomezclador Eppendorf a 7°C, 14 r.p.m. durante 15 min. La reacción se detiene colocando los tubos en el hielo. Las muestras son centrifugadas en frío a 14 g durante 3 min, y se mide OD59 en el sobrenadante. El valor ODsgo de las muestras en blanco se sustrae de los valores correspondientes de las muestras tratadas con proteasa. La termoestabilidad de la proteasa se determina calculando la actividad de porcentaje de las muestras preincubadas a 7° en comparación con las muestras incubadas en hielo (1%).

[8] En un aspecto, la proteasa es obtenible a partir de Nocardiopsis, Thermoascus o Badllus.

[9] En un aspecto, la invención se refiere a un método de elaboración de una cerveza que comprende poner en contacto un mosto después del filtrado pero antes del hervido del mosto con una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde con las SEC ID n° 1, 2, o 3 y variantes de las mismas que tienen al menos el 7% de identidad con las SEC ID n° 1,2, o 3.

[1] En un aspecto, el método lleva a una reducción en la neblina en el producto de cerveza.

[11] En un aspecto, la invención se refiere a un método de elaboración de una cerveza que comprende poner en contacto una malta remojada durante el filtrado y/o un mosto después del filtrado pero antes del hervido del mosto con una proteasa termoestable por lo cual aumenta la estabilidad coloidal cuando se compara con la cerveza fermentada de forma convencional.

[12] En un aspecto, la puesta en contacto se lleva a cabo a una temperatura de al menos 6 grados centígrados (posteriormente referido aquí como °C). En otro aspecto, la temperatura es al menos 7°C. En otro aspecto, la temperatura es al menos 74°C, más preferiblemente al menos 75°C, más preferiblemente al menos 76°C, más preferiblemente al menos 77°C y de la forma más preferible al menos 78°C.

[13] En un aspecto, la puesta en contacto se lleva a cabo durante un periodo entre 1 minutos (posteriormente referido aquí como min) y 5 horas, preferiblemente, la puesta en contacto es entre 2 min y 3 horas, más preferiblemente entre 3 min y 2 horas y de la forma más preferible entre 3 min y 1 hora.

Breve descripción de los dibujos

[14] La Fig. 1 muestra la medición de neblina en el mosto y cerveza recibida de una malta remojada tratada con una proteasa de la SEC ID n° 1 frente a la malta remojada no tratada (control). El eje Y denota los valores en unidad nefeiométrlca de turbidez (NTU).

Descripción detallada de la Invención

[15] El proceso de elaboración de cerveza es bien conocido por el experto en la técnica. Se puede perfilar un procedimiento convencional de la siguiente manera: la materia prima es cebada malteada (es decir humectada, germinada y posteriormente secada) y/o adjuntos no malteados, llamados molienda. Durante la trituración, donde la molienda es molida y mezclada con agua, calentada y agitada, los carbohidratos se degradan a azúcares fermentables con la ayuda de las enzimas naturalmente presentes en la malta. Después de la trituración, es necesario separar el extracto líquido (el mosto) de los sólidos (partículas de bagazo y adjuntos) para obtener mosto claro. Este proceso se describe como filtrado. Antes del filtrado, la temperatura de la malta remojada puede ser elevada a aproximadamente 75-78°C (165-173°F) (conocido como mashout). El filtrado del mosto es importante debido a que los sólidos están enriquecidos con grandes cantidades de proteína, almidón pobremente modificado, materia grasa, silicatos, y polifenoles (taninos) y proteínas. El extracto retenido en el bagazo después de la recogida del primer mosto también puede ser lavado añadiendo agua caliente encima de la torta de filtrado. Este proceso es llamado lavado. El agua caliente fluye a través del bagazo y disuelve el extracto restante. El mosto diluido se llama segundo mosto y su extracto reduce desde la gravedad original del primer mosto hasta 1-2 %. Después de la adición de lúpulo, el mosto es hervido. Por la presente numerosas sustancias incluyendo diferentes proteínas son desnaturalizadas y tendrá lugar una precipitación de polifenoles. Tras el enfriamiento y la eliminación de los precipitados, el mosto de cerveza final (a) se airea y se añade levadura. Después de una fermentación principal, que dura normalmente 5-1 días, la mayor parte de la levadura es eliminada y la así llamada cerveza verde (b) es almacenada a baja temperatura, normalmente a - 5°C durante 1-12 semanas. Durante este periodo la levadura restante precipitará junto con los polifenoles. Para eliminar el exceso restante de polifenoles se realiza una filtración. La cerveza fermentada (c) puede ahora ser carbonizada antes del embotellado. El dióxido de carbono no sólo contribuye a la "plenitud" o "cuerpo" percibidos y como intensificadorde sabor, también actúa en cuanto a la mejora del potencial de formación... [Seguir leyendo]

1. Método de elaboración de una cerveza que comprende la adición de una proteasa temnoestable a un mosto después del filtrado pero antes del hervido del mosto, donde temnoestable significa que la actividad de la proteasa es al menos el 7% de la actividad de referencia cuando es evaluada según el siguiente método:

La proteasa es diluida a ImgAnl en un tampón de ensayo que comprende 1 mM ácido succínioo, 1 mM HEPES, 1 mM CHES, 1 mM CABS, 1 mM CaCI2, 15 mM KCL,.1% Tritón X-1, pH ajustado a 5.5 con NaOH. La proteasa es entonces preincubada en i) hielo, ii) 1 min a 7°C. El sustrato para el que la proteasa tiene actividad es suspendido en.1% Tritón X-1. Para iniciar la reacción, se añaden 2 pl al tubo y se incuba en un termomezclador Eppendorf a 7°C, 14 r.p.m. durante 15 min. La reacción se detiene colocando los tubos en hielo. Las muestras son centrifugadas en frío a 14 g durante 3 min, y se mide el OD59 en el sobrenadante. El valor OD59 de las muestras en blanco es sustraído de los valores correspondientes de las muestras tratadas con proteasa. La termoestabilidad de la proteasa se determina calculando la actividad porcentual de las muestras preincubadas a 7° en comparación con la actividad de referencia, que es la actividad de la proteasa de las muestras incubadas en hielo.

2. Método según la reivindicación 1, donde la proteasa es obtenible a partir de Nocaidiopsis, Thermoascus o Bacillus.

3. Método según la reivindicación 1, donde la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la SEC ID n° 1 o variantes de la misma que tengan al menos un 7% de identidad con la SEC ID n° 1.

4. Método según la reivindicación 1, donde la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la SEC ID n°2 o variantes de la misma que tengan al menos un 7% identidad con la SEC ID n°2.

5. Método según la reivindicación 1, donde la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la SEC ID n° 3 o variantes de la misma que tengan al menos el 7% de identidad con la SEC ID n°

3.

6. Método según la reivindicación 1, donde la adición de la proteasa temnoestable al mosto se lleva a cabo a una temperatura de al menos 6°C.

7. Método según la reivindicación 1, donde la adición de la proteasa temnoestable al mosto se lleva a cabo a una temperatura de al menos 7°C.

8. Método según la reivindicación 1, donde la adición de la proteasa temnoestable al mosto se lleva a cabo a una temperatura de al menos 75°C.

9. Método según la reivindicación 1, donde la adición de la proteasa temnoestable al mosto se lleva a cabo durante un periodo entre 1 min y5 horas.

1. Método según la reivindicación 2, donde la proteasa es obtenible a partir de N. dassonvillei, Thermoascus arantiacus o Bacillius licheniformis.