Método de aislamiento de citoblastos dérmicos.

Un método de aislamiento de citoblastos dérmicos que comprende:

someter a células separadas de la piel por tratamiento enzimático a un cultivo en suspensión; y

aislar las células positivas de marcadores de citoblastos de las células cultivadas, siendo las células positivas de marcadores de citoblastos las células positivas de CD34.

Método de aislamiento de citoblastos dérmicos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de aislamiento de citoblastos dérmicos a partir de tejido cutáneo. Antecedentes de la invención

Los citoblastos son células que tienen tanto propiedades de potencial multipotente de producción de células que se diferencian en una pluralidad de células como potencial autorreplicativo de producción de células idénticas mediante división celular. Los citoblastos derivados de un embrión, una etapa de desarrollo temprana de un óvulo fertilizado, son citoblastos embrionarios (CE). Se espera que los CE humanos se apliquen a medicina regenerativa pero, debido a preocupaciones éticas asociadas al uso de óvulos fertilizados, no está permitida la creación de nuevos CE.

En los últimos años, como células que tienen propiedades similares a los citoblastos embrionarios, se ha centrado también la atención en citoblastos pluripotentes inducidos artificialmente (CPi). Sin embargo, la creación de CPi está asociada a diversos problemas tales como cambios cancerosos en células y mala eficacia de generación de células. Por otro lado, los citoblastos somáticos capaces de diferenciarse en un tejido específico no tienen dichos problemas éticos, al contrario que los citoblastos embrionarios, puesto que derivan del propio tejido del paciente, tal como médula ósea.

Es bien conocido que, en la piel, existen citoblastos epidérmicos en la capa basal epidérmica (documento no de patente 1) y se reseña que existen citoblastos epiteliales foliculares (documento no de patente 2) y citoblastos melanocíticos cutáneos (documento no de patente 3) en una región a la que se hace referencia como la zona de protuberancia del folículo piloso. Por otro lado, en la dermis están presentes fibroblastos finos fusiformes en el componente fibroso que comprenden colágeno como ingrediente principal, pero no se ha demostrado si están presentes citoblastos en los fibroblastos dérmicos. Es también conocido que en la dermis existen células precursoras derivadas de la piel (SKP) que se diferencian en una pluralidad de linajes celulares tales como adipocitos, gliocitos, condrocitos y miocitos (documento no de patente 4), pero no se ha confirmado ninguna relación entre fibroblastos dérmicos y SKP.

Los citoblastos mesenquimáticos aislados de médula ósea como células precursoras de fibroblastos (documento no de patente 5) pueden diferenciarse en diversas células (osteocitos, miocitos, condrocitos, adipocitos, etc.) pertenecientes al sistema mesenquimático, y por tanto se espera que se apliquen a medicina regenerativa, tal como a reconstrucción de huesos, vasos sanguíneos y músculos. Últimamente, hay cada vez más pruebas que muestran la probabilidad de que los citoblastos mesenquimáticos puedan aparecer en muchos tejidos que tienen tejido mesenquimático, y se han aislado también citoblastos mesenquimáticos de grasa, sangre del cordón, placenta, etc. (documentos no de patente 6 a 8). Sin embargo, la presencia de citoblastos mesenquimáticos en la dermis no se ha mostrado todavía.

Documentos de la técnica anterior Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Watt FM, J. Dermatol. Sci. 28: 173-18, 22 Documento no de patente 2: Cotsarelis G et al., Cell 57: 21-29, 1989 Documento no de patente 3: Nishimura EK et al., Nature 416: 854-86, 22 Documento no de patente 4: Wong CE et al., J. Cell Biol. 175: 15-115, 26 Documento no de patente 5: Pittenger MF et al., Science 284: 143-147, 1999 Documento no de patente 6: Park KW et al., Cell Metab. 8: 454-457, 28 Documento no de patente 7: Flynn A, etal., Cytotherapy 9: 717-726,27 Documento no de patente 8: Igura K et al., Cytotherapy 6: 543-553, 24 Sumario de la invención Problemas para resolver por la invención

Existen muy pocos citoblastos mesenquimáticos en la médula ósea, y la sangre del cordón y placenta derivan de un número muy limitado de sujetos, y por lo tanto están limitados como fuente de citoblastos mesenquimáticos autólogos. Si pueden aislarse citoblastos mesenquimáticos de la dermis, la piel puede proporcionar una fuente muy importante de citoblastos mesenquimáticos para uso en medicina regenerativa y medicina cosmética. Por tanto, es

un objeto de la presente invención proporcionar un método de aislamiento de citoblastos mesenquimáticos de la dermis.

Después de una investigación para demostrar la presencia de citoblastos mesenquimáticos en la dermis, asi como para establecer un método para aislar eficazmente los citoblastos mesenquimáticos, el presente inventor ha confirmado realmente la presencia de células positivas de marcadores de citoblastos en la zona perivascular de la dermis (humana). Sin embargo, cuando el tejido cutáneo se trata con enzima con el fin de aislar las células, puede reducirse notablemente la expresión de los marcadores de citoblastos específicos. En el cultivo en suspensión de las células tratadas con enzima, el presente inventor ha encontrado que no solo se restaura la expresión de marcadores de los citoblastos, sino que las células mantienen una alta capacidad de diferenciación en comparación con células cultivadas por adhesión, y por lo tanto ha completado la presente invención.

Por tanto, la presente invención engloba las siguientes invenciones:

(1) Un método de aislamiento de citoblastos dérmicos que comprende:

someter a células separadas de la piel por tratamiento enzimático a cultivo en suspensión, y

aislar las células positivas de marcadores de citoblastos de las células cultivadas, en el que las células positivas de marcadores de citoblastos son las células positivas de CD34.

(2) El método según (1), en el que las células positivas de CD34 son adicionalmente positivas de NG2.

(3) El método según (1) o (2), en el que el cultivo en suspensión se lleva a cabo durante un periodo de tiempo suficiente para restaurar la expresión de marcadores de citoblastos en las células.

Efectos de la invención

Sin desear ligarse a ninguna teoría, se cree que los citoblastos dérmicos aparecen en la zona de la microvasculatura como población de células de tipo pericito, y que se activan en el momento de lesión cutánea y se diferencian en fibroblastos y miofibroblastos, contribuyendo así a la regeneración y restauración cutáneas. También se espera que los citoblastos se consuman debido al envejecimiento y estimulación cutánea, lo que da como resultado no solo la reducción de la función cutánea, sino la reducción de la capacidad regenerativa cutánea y la Inestabilidad de los vasos sanguíneos, causando así el envejecimiento de la piel.

De acuerdo con el método de la presente invención, pueden aislarse fácilmente citoblastos dérmicos. Los citoblastos dérmicos obtenidos mediante la presente invención se espera que contribuyan a la elucidación del mecanismo de homeostasia y envejecimiento cutáneos y que se usen en medicina regenerativa.

Breve explicación de los dibujos

Fig. 1

La Fig. 1 muestra una microfotografía de células de tipo fibroblasto obtenidas mediante el cultivo de células altamente adhesivas entre células aisladas de dermis humana según el método de la presente invención en un medio para citoblastos mesenquimáticos.

Fig. 2

La Fig. 2 muestra colonias formadas por las células de tipo fibroblasto de la Fig. 1.

Fig. 3

La Fig. 3 muestra que las células de tipo fibroblasto pueden diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos.

Fig. 4

La Fig. 4 representa una tinción histoquímica de una zona de vaso sanguíneo de la dermis teñida usando los marcadores de citoblastos CD34 y NG2, así como el agente de tinción nuclear Hoechst 33258.

Fig. 5

La Fig. 5 representa una microfotografía que muestra la capacidad formadora de colonias de una fracción celular obtenida mediante clasificación de células positivas de CD34 derivadas de dermis humana.

Fig. 6

La Fig. 6 representa una microfotografía que muestra que las células positivas de CD34 derivadas de dermis humana son citoblastos mesenquimáticos dérmicos que se diferenciarán en grasa y hueso.

Fig.7

La Fig. 7 representa una gráfica que muestra la relación de expresión génica de los marcadores de cltoblastos mesenqulmátlcos NANOG, SDF-1a y HGF en los citoblastos dérmicos obtenidos según el método de la presente Invención, en que la relación de expresión era una comparación con la cantidad expresada por los cltoblastos obtenidos mediante el cultivo por adhesión.

Modo de llevar a cabo la invención

La presente Invención proporciona un método de aislamiento de citoblastos dérmicos que comprende:

1. Un método de aislamiento de citoblastos dérmicos que comprende:

someter a células separadas de la piel por tratamiento enzimático a un cultivo en suspensión; y

aislar las células positivas de marcadores de citoblastos de las células cultivadas, siendo las células positivas de 5 marcadores de citoblastos las células positivas de CD34.

2. El método según la reivindicación 1, en el que las células positivas de CD34 son adicionalmente positivas de NG2.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que se lleva a cabo el cultivo en suspensión durante un periodo de tiempo suficiente para restaurar la expresión de los marcadores de citoblastos en las células.