Agregado de células que comprende diversas clases de células derivadas del soma con capacidad para formar una estructura de tipo órgano primitivo.

Un método para preparar una masa celular capaz de servir como estructura de tipo de órgano primitivocompuesta de combinaciones de queratinocitos (células somáticas epiteliales) y células de la papila capilar (célulassomáticas mesenquimales),

que comprende:

preparar cultivos que contienen queratinocitos y células de la papila capilar;

mezclar dichos cultivos de queratinocitos y de células de la papila capilar y a continuación añadir un activador de laseñal de Wnt que demuestra una actividad inhibidora sobre la glucógeno-sintasa-quinasa-3 (GSK-3) para el cultivomixto de células;

someter el cultivo que contiene dicho activador de la señal de Wnt al método de la gota colgante o método deformación de esferoides durante un período de tiempo predeterminado; y

reemplazar el medio del cultivo cultivado por el método de la gota colgante o método de formación de esferoides conmedio que no contiene activador de la señal de Wnt y seguir cultivando durante un periodo de tiempopredeterminado; en donde,

al menos un tipo de los queratinocitos y las células de papila capilar se mantiene en un estado no diferenciado.

Agregado de células que comprende diversas clases de células derivadas del soma con capacidad para formar una estructura de tipo órgano primitivo Campo Técnico La presente invención se refiere a un método para producir una masa celular capaz de servir como estructura de tipo órgano primitivo formada por diversos tipos de células de origen somático.

Técnica Anterior

Gracias a los notables avances que se han hecho en el campo de la medicina en los últimos años, las oportunidades de salvar vidas han seguido aumentando eliminando las causas de las enfermedades mediante, por ejemplo, las técnicas terapéuticas sistemáticas en forma de la extirpación quirúrgica del cáncer o las técnicas de trasplante de donantes vivos para tejidos y órganos. Sin embargo, hay casos en los que los pacientes sufren una considerable disminución en la QOL (Quality Of Life: calidad de vida) que acompaña a la escisión del área afectada. Además, existen limitaciones en el tratamiento que dependen de trasplantes de donantes vivos debido a factores tales como la escasez de donantes para trasplante y la aparición de rechazo. Si fuera posible regenerar un tejido o un órgano que se ha perdido debido a un tratamiento quirúrgico o a un accidente imprevisto, entonces sería posible mejorar considerablemente la calidad de vida de los pacientes. Además, la medicina regenerativa hace posible también resolver los problemas que afrontan los trasplantes de donantes vivos. Desde este punto de vista, el grado de las expectativas puestas en la medicina regenerativa es elevado.

Las tecnologías en las que la medicina regenerativa ha obtenido éxito están relacionadas principalmente con tejido comparativamente simple en términos de morfología o función a la manera de la piel artificial, hueso artificial y dientes artificiales. La piel artificial y el hueso artificial reconstruidos se incorporan en células que permiten que se proporcionen las señales que se requieren para la construcción de tejidos. Sin embargo, ha habido limitaciones en el repertorio de la diferenciación de la piel artificial y hueso artificial por técnicas de medicina regenerativa. Por ejemplo, aunque los queratinocitos alogénicos o fibroblastos de la piel y similares se diferencian en estructuras en forma de epidermis, son incorporados por los órganos circundantes para tener eventualmente una capa córnea o capa basal que tiene propiedades de barrera, se ha publicado que no hay derivación de derivados secundarios tales como folículos pilosos, glándulas sebáceas o glándulas sudoríparas.

El tejido corporal contiene normalmente tanto células que son capaces de auto-replicarse y que tienen propiedades de células madre para mantener la homeostasis del tejido enviando señales a las células diferenciadas o suministrar células diferenciadas, como células que tienen propiedades de células somáticas que ya se han diferenciado que reciben diferentes señales u órdenes a partir de tales células, y es capaz de funcionar a través de la interacción entre ambos tipos de células. En el caso de los vertebrados, por ejemplo, la interacción entre las células mesenquimales y las células epiteliales es esencial para la formación de casi todos los tejidos y órganos. En el caso de los folículos pilosos, las células mesenquimales en forma de células de la papila capilar son responsables de las propiedades del tipo de las de las células madre, mientras que las células epiteliales en forma de queratinocitos son equivalentes a las células que tienen propiedades similares a las de las células somáticas en el sentido de que se diferencian en cabellos (el propio pelo) .

La dificultad que se encuentra cuando se forman órganos mediante la medicina regenerativa estriba en alcanzar un estado de coexistencia entre las células que tienen propiedades similares a las de las células madre mantenidas en un estado no diferenciado y las células que ya se han diferenciado como en el tejido corporal real. En la técnica anterior, incluso si las células epiteliales y las células mesenquimales pudieron ser cultivadas en común, o terminaron la diferenciación o bien ambas mantuvieron un estado no diferenciado, evitando de esta manera la reproducción de la coexistencia de células no diferenciadas y células diferenciadas para imitar tejido corporal real.

Descripción De La Invención Un objeto de la presente invención es proporcionar una masa celular capaz de servir como estructura de tipo órgano primitivo combinando y cultivando una diversidad de tipos de células somáticas diferenciadas.

La presente solicitud incluye las siguientes invenciones:

(1) Un método para preparar una masa celular capaz de servir como estructura de tipo de órgano primitivo compuesta de combinaciones de queratinocitos (células somáticas epiteliales) y células de la papila capilar (células somáticas mesenquimales) , que comprende:

preparar cultivos que contienen queratinocitos y células de la papila capilar;

mezclar dichos cultivos de queratinocitos y de células de la papila capilar y a continuación añadir un activador de la señal de Wnt que muestra una actividad inhibidora sobre la glucógeno-sintasa-quinasa-3 (GSK-3) para el cultivo mixto de células;

someter el cultivo que contiene dicho activador de la señal de Wnt al método de la gota colgante o método de formación de esferoides durante un período de tiempo predeterminado; y

reemplazar el medio de cultivo cultivado por el método de la gota colgante o método de formación de esferoides con medio que no contiene activador de la señal de Wnt y seguir cultivando durante un periodo de tiempo 5 predeterminado; en donde,

al menos un tipo de los queratinocitos y las células de papila capilar se mantiene en un estado no diferenciado;

(2) el método de (1) , en el que el activador de la señal de Wnt que muestra una actividad inhibidora sobre GSK3 se elige a partir del compuesto bis-indolo (indirrubina) , (BIO) ( (2'Z, 3'E) -6-bromoindirrubin-3'-oxima) , su análogo acetoxima, BIO-acetoxima (2'Z, 3'E) -6-bromoindirrubin-3'-acetoxima) , análogo de tiadiazolidina (TDZD) (4-bencil-2

etil-1, 2, 4-tiadiazolidin-3, 5-diona) y el análogo de oxotiadiazolidina-3-tiona (2, 4-dibencil-5-oxotiazolidin-3-tiona) , un compuesto de α-clorometil tienil cetona (2-cloro-1- (4, 4-dibromo-tiofen-2-il) -etanona) , un compuesto de fenil αbromometil cetona (a-4-dibromoacetofenona) , un compuesto de urea que contiene tiazol (N-4-metoxibencil) -N'- (5 nitro-1, 3-tiazol2-il-urea) e inhibidores de péptidos GSK-3β tales como H-KEAPPAPPQSpP-NH2;

(3) El método de cualquiera de los apartados (1) y (2) , en el que los folículos pilosos que tienen una función 15 inductora de folículo capilar se forman a partir de la masa celular;

(4) El método de cualquiera de los apartados (1) a (3) , en el que el activador de la señal de Wnt es 6bromoindirrubin-3'-oxima (BIO) .

Breve Descripción De Los Dibujos La FIG. 1 es un diagrama de inmunotinción (1) de una masa celular producida de acuerdo con el método de la 20 presente invención, que muestra la tinción de células DP y células NHEK;

La FIG. 2 es un diagrama de inmunotinción (2) de una masa celular producida de acuerdo con el método de la presente invención, que muestra la localización de las células de la papila capilar en la masa celular;

La FIG. 3 es un diagrama de inmunotinción (3) de una masa celular producida de acuerdo con el método de la presente invención, que muestra la proliferación de las células en la masa celular;

La FIG. 4 es un diagrama de inmunotinción (4) de una masa celular producida de acuerdo con el método de la presente invención, que muestra la tinción de β-catequina y células NHEK;

La FIG. 5 es un diagrama de inmunotinción (5) de una masa celular producida de acuerdo con el método de la presente invención que muestra la expresión de la queratina capilar en la masa celular;

La FIG. 6 es un diagrama de inmunotinción (6) de una masa celular producida de acuerdo con el método de la 30 presente invención que muestra la expresión de yemas capilares en la masa celular;

La FIG. 7 muestra la expresión de diversos genes en ARN que se originan en una masa celular de la presente invención (1) ;

La FIG. 8 muestra la expresión del gen Wnt3A en ARN que se originan en una masa celular de la presente invención;

La FIG. 9 muestra la expresión del gen Wnt10b en ARN que se origina en una masa celular de la presente invención; y

La FIG. 10 muestra la expresión de diversos genes en ARN que se originan en una masa celular de la presente invención (2) .

Modo Mejor De Llevar A Cabo La Invención De... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una masa celular capaz de servir como estructura de tipo de órgano primitivo compuesta de combinaciones de queratinocitos (células somáticas epiteliales) y células de la papila capilar (células somáticas mesenquimales) , que comprende:

preparar cultivos que contienen queratinocitos y células de la papila capilar;

mezclar dichos cultivos de queratinocitos y de células de la papila capilar y a continuación añadir un activador de la señal de Wnt que demuestra una actividad inhibidora sobre la glucógeno-sintasa-quinasa-3 (GSK-3) para el cultivo mixto de células;

someter el cultivo que contiene dicho activador de la señal de Wnt al método de la gota colgante o método de 10 formación de esferoides durante un período de tiempo predeterminado; y

reemplazar el medio del cultivo cultivado por el método de la gota colgante o método de formación de esferoides con medio que no contiene activador de la señal de Wnt y seguir cultivando durante un periodo de tiempo predeterminado; en donde,

al menos un tipo de los queratinocitos y las células de papila capilar se mantiene en un estado no diferenciado.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el activador de la señal de Wnt que demuestra una actividad inhibidora sobre GSK-3 se elige a partir del compuesto bis-indolo (indirrubina) , (BIO) ( (2'Z, 3'E) -6-bromoindirrubin-3'oxima) , su análogo acetoxima, BIO-acetoxima (2'Z, 3'E) -6-bromoindirrubin-3'-acetoxima) , análogo de tiadiazolidina (TDZD) (4-bencil-2-etil-1, 2, 4-tiadiazolidina-3, 5-diona) y el análogo de oxotiadiazolidina-3-tiona (2, 4-dibencil-5ºxotiazolidina-3-tiona) , un compuesto de tienil α-clorometil cetona (2-cloro-1- (4, 4-dibromo-tiofen-2-il) -etanona) , un compuesto de fenil α-bromometil cetona (a-4-dibromoacetofenona) , un compuesto de urea que contiene tiazol (N-4metoxibencil) -N'- (5 -nitro-1, 3-tiazol2-il-urea) e inhibidores de péptido GSK-3β tales como H-KEAPPAPPQSpP-NH2.

3. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en el que los folículos capilares que tienen una función inductora del folículo capilar se forman a partir de la masa celular.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el activador de la señal de Wnt es 625 bromoindirrubin-3'-oxima (BIO) .