Kits y procedimientos para eliminar contaminantes de ácidos nucleicos en muestras ambientales y biológicas.

Un método para eliminar un contaminante o inhibidor de una muestra que comprende ácido nucleico,

donde el contaminante o inhibidor inhibe la amplificación o hibridación del ácido nucleico en la muestra, o inhibe una reacción enzimática que utiliza el ácido nucleico en la muestra, comprendiendo el método los pasos de:

(a) procesar la muestra para romper, desnaturalizar o alterar la muestra, donde el procesamiento comprende poner en contacto la muestra con una solución que comprende un agente caotrópico, un detergente y un amortiguador;

(b) poner en contacto la muestra con un primer floculante para formar un precipitado floculante, donde el primer floculante es acetato de amonio;

(c) aislar el ácido nucleico y contaminantes e inhibidores restantes del primer precipitado floculante en un sobrenadante;

(d) poner en contacto el sobrenadante que contiene ácido nucleico con un segundo floculante para formar un segundo precipitado floculante, donde el segundo floculante es sulfato de amonio y aluminio o sulfato de amonio y aluminio dodecahidratado; y

(e) aislar el ácido nucleico del segundo precipitado floculante en un sobrenadante.

Kits y procedimientos para eliminar contaminantes de ácidos nucleicos en muestras ambientales y biológicas CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona métodos y composiciones, p.ej., kits, para eliminar los contaminantes de ácidos nucleicos en una muestra, p.ej., muestras biológicas o ambientales como muestras de suelo, alimento, plantas, animales, microorganismos o agua. La invención proporciona métodos y composiciones, p.ej., kits, para aislar los ácidos nucleicos de muestras, incluyendo muestras biológicas o ambientales como muestras de suelo, alimento, plantas, animales, microorganismos o agua. La invención hace referencia a métodos y composiciones para detectar organismos, p.ej., microorganismos, en una muestra, p.ej., una muestra biológica o ambiental. Los ácidos nucleicos aislados usando los kits y métodos de la invención son útiles para llevar a cabo una variedad de procesos aplicables a la agricultura, investigación forense, zoología y combatir el bioterrorismo. Por ejemplo, estos ácidos nucleicos son útiles en las áreas de aplicaciones biológicas moleculares, incluyendo, por ejemplo, analíticas, clonación, diagnóstico y detección en los campos de la agricultura, horticultura, silvicultura, investigación forense, investigación biológica, identificación y caracterización de composición de muestras y

organismos.

ANTECEDENTES

Las secuencias de ácido nucleico presentan una amplia variedad de aplicaciones en el campo de la biología molecular. Son una herramienta valiosa en las técnicas analíticas y de aplicación usadas en el campo de la biología molecular, la salud y la medicina (terapia génica, diagnóstico, expresión de proteína recombinante) , 20 bioterrorismo (análisis y detección de agentes) , investigación forense, ciencia espacial y ciencia de la alimentación. Algunos ejemplos de estas técnicas incluyen genotipado de microorganismos, obtención de la huella genética de plantas y animales, detección de patógenos y microorganismos beneficiosos en suelos, agua, plantas y animales, identificación forense de muestras biológicas y muestras ambientales contaminadas con diferentes entidades biológicas. Todas estas técnicas se basan en la identificación de una secuencia específica 25 de ácido nucleico bien en una muestra biológica, como un microorganismo, tejido vegetal o tejido animal, o bien en cualquier ambiente capaz de soportar la vida. La identificación de secuencias de ácido nucleico diana directamente en muestras biológicas y en muestras ambientales presenta las ventajas de la rapidez, precisión, alto rendimiento y un bajo límite de detección para cantidades de picogramos o femtogramos de ácidos nucleicos. La secuencia de ácido nucleico diana, para ser usada como herramienta de diagnóstico en tales aplicaciones, debe estar libre de contaminantes que inhiben la PCR y otras aplicaciones posteriores. Estos contaminantes son a menudo de grupos que incluyen polifenoles, polisacáridos y sustancias húmicas.

El campo de extracción de ácido nucleico y posterior amplificación de este ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha revolucionado el rápido análisis de la composición genética de diversos ecosistemas. Hay disponibles métodos y kits para aislar ADN genómico desde una amplia gama de entidades 35 biológicas y desde el entorno en el que viven estas entidades vivas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica analítica muy poderosa y sensible con aplicaciones en muchos campos diversos, que incluyen la biología molecular, diagnosis clínica, análisis forense y genética de poblaciones. Sin embargo, la tasa de éxito en análisis genómico de plantas y suelo ha sido relativamente baja debido a la baja calidad del ADN aislado. En el análisis de ADN genómico de plantas, el ADN es coextraído de manera invariable con otros componentes vegetales como polifenoles y polisacáridos que inhiben las aplicaciones de la PCR.

En el campo de ecosistemas del suelo, los métodos de extracción de ácido nucleico sufren ineficiencias compuestas de sorción de ADN a superficies del suelo y coextracción de inhibidores enzimáticos de los suelos. Tanto la arcilla como las fracciones orgánicas del suelo afectan al aislamiento y purificación de ADN. La arcilla tiene una tendencia a unirse al ADN de manera adsorbente, mientras que los polímeros húmicos que se 45 encuentran en la fracción orgánica tienden a copurificar con ADN durante el procedimiento de extracción. Cuanto más contenido hay de montmorillonita y materia orgánica, mayor la capacidad amortiguadora del sistema de suelo y también mayor la cantidad de ADN adsorbido a las partículas de suelo. De ese modo, los métodos desarrollados para un tipo de suelo particular con una ratio de arcilla:materia orgánica pueden no funcionar para ningún otro tipo de suelo con distinta ratio arcilla:materia orgánica. Se ha informado de manera previa que la 50 extracción de fenol de ADN contaminado con sustancias húmicas resultó en una disminución de la eficiencia en la recuperación de ADN. El compost puede tener una variedad de compuestos orgánicos adicionales que pueden copurificarse con el ADN e inhibir las manipulaciones enzimáticas del ADN. Otra preocupación adicional al aislar ADN microbiano de compost en que el material vegetal en diversas etapas de descomposición puede estar presente en concentraciones significativas en el compost.

En estudios de organismos superiores como hongos, plantas y animales, el aislamiento de ácido nucleico directo todavía afronta problemas de calidad. En cianobacterias, hongos, algas y plantas, pigmentos y componentes de la pared celular como quitinas y polisacáridos inhibirán la PCR. Estos tipos celulares son ricos

en endonucleasas y exonucleasas y contienen pigmentos fotosintéticos, que pueden inhibir reacciones enzimáticas, especialmente transcripción inversa y PCR.

La naturaleza de los contaminantes en preparaciones de ácido nucleico bruto de suelos y sedimentos y sus interacciones con ADN y ARN no se comprende bien. Con mucha frecuencia, estos contaminantes se 5 consideran ácidos húmicos y fúlvicos y una mezcla heterogénea de oligómeros y polímeros fenólicos. Las sustancias húmicas se forman cuando los microbios degradan residuos vegetales y se estabilizan para la degradación por unión covalente de sus sitios reactivos a iones metálicos y minerales arcillosos. Las sustancias húmicas constan de aromáticos policíclicos a los que se unen sacáridos, péptidos y fenoles. Los tipos predominantes de sustancias húmicas en suelos son ácidos húmicos (HA, peso molecular de 300 kDa y superior) 10 y ácidos fúlvicos (FA, peso molecular tan bajo como 0, 1 kDa) . Los ácidos húmicos son solubles en pH alcalino y precipitan con ácidos sulfúricos o clorhídricos a pH de 1, 0 a 2, 0, mientras que los ácidos fúlvicos permanecen en solución incluso a pH ácido (Stevenson, 1994) . Con frecuencia, los extractos de ADN de suelos que muestran coloración marrón indican la contaminación con sustancias de tipo húmico. Estos compuestos marrones no pueden eliminarse fácilmente de los extractos de ADN. La extracción de solvente de extractos de ADN brutos 15 con solvente como fenol, éter dietílico, acetona, metanol y etanol no tuvo éxito en la eliminación de la coloración marrón, y el ADN fue decolorado aún y era resistente a la digestión mediante endonucleasas de restricción. Algunos de estos compuestos también parecen migrar junto con el ADN durante la ultracentrifugación isopícnica con CsCl-bromuro de etidio, resultando en una coloración marrón clara del ADN recuperado. Estas observaciones implican una íntima asociación entre los contaminantes y el ADN. Aunque la naturaleza de la asociación entre compuestos contaminantes y ADN no ha sido explicada, el enlace reversible e irreversible de polifenoles, como taninos, a proteínas es bien comprendido.

La extracción directa de ácido nucleico total de suelos o sedimentos normalmente resulta en la coextracción de otros componentes del suelo, principalmente ácidos húmicos u otras sustancias húmicas, que interfieren de manera negativa en los procesos de detección y transformación de ADN. Se ha afirmado que estas 25 sustancias inhiben las endonucleasas de restricción y polimerasa Taq, la enzima clave de la PCR, y disminuyen la eficiencia en las hibridaciones ADN-ADN. La separación de sustancias húmicas de ADN normalmente conlleva mucho tiempo y tediosos pasos. Para evitarlo, se han usado ampliamente la cromatografía de exclusión por tamaño y el uso de columnas de centrifugado de polivinilpolipirrolidona. La cromatografía de exclusión por tamaño incluye el uso de SEPHADEX G-200™ o MICROSPIN S-400 HR™, aunque también se ha presentado... [Seguir leyendo]

1. Un método para eliminar un contaminante o inhibidor de una muestra que comprende ácido nucleico, donde el contaminante o inhibidor inhibe la amplificación o hibridación del ácido nucleico en la muestra, o inhibe una reacción enzimática que utiliza el ácido nucleico en la muestra, comprendiendo el método los pasos de:

(a) procesar la muestra para romper, desnaturalizar o alterar la muestra, donde el procesamiento comprende poner en contacto la muestra con una solución que comprende un agente caotrópico, un detergente y un amortiguador;

(b) poner en contacto la muestra con un primer floculante para formar un precipitado floculante, donde el primer floculante es acetato de amonio;

(c) aislar el ácido nucleico y contaminantes e inhibidores restantes del primer precipitado floculante en un sobrenadante;

(d) poner en contacto el sobrenadante que contiene ácido nucleico con un segundo floculante para formar un segundo precipitado floculante, donde el segundo floculante es sulfato de amonio y aluminio o sulfato de amonio y aluminio dodecahidratado; y

(e) aislar el ácido nucleico del segundo precipitado floculante en un sobrenadante.

2. El método de la reivindicación 1, donde el contaminante o inhibidor se selecciona entre el grupo compuesto por un polifenol, un polisacárido, una sustancia húmica, un ácido húmico, una humina y un fenólico de plantas.

3. El método de la reivindicación 1, donde la muestra comprende una muestra ambiental o biológica, y

opcionalmente la muestra ambiental o biológica comprende una muestra derivada de un animal, restos animales, un alimento, un microorganismo, una planta o sus componentes, suelo, sedimento, roca, arrecife, lodo, compost, materia biológica en descomposición, una biopsia, una muestra histológica, una muestra de semen, una muestra de saliva o sangre, cualquier muestra de fluido corporal, una muestra de pelo, una muestra de piel, una muestra fecal, restos arqueológicos, una turbera, compost, aceite, agua, agua terrestre o agua subterránea, agua industrial y atmosférica, polvo, polvo urbano, mezclas comerciales para sembrar o mejoradores del suelo, respiraderos del fondo marino, o aire.

4. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico comprende un ARN o ADN o una combinación de los mismos.

5. El método de la reivindicación 1, donde el detergente se selecciona entre el grupo compuesto por dodecil

sulfato sódico (SDS) , sarkosyl, lauril sarcosinato de sodio, bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) , ácido cólico, ácido desoxicólico, benzamidotaurocolato (BATC) , octilfenol polietoxilato, monolaurato de sorbitán polioxietilenado, terc-octilfenoxi poli (oxietileno) etanol, 1, 4-piperazinabis- (ácido etanosulfónico) , ácido N- (2acetamido) -2-aminoetanosulfónico, polietilenglicol terc-octilfenil éter (Triton®X-100) , (1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) fenilpolietilenglicol (Triton®X-114) y una combinación de los mismos.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende además; (f) purificar o aislar el ácido nucleico y/o (g) detectar el ácido nucleico, donde la detección resulta en la determinación de que el ácido nucleico es de un organismo que produce una espora o una toxina.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la toxina es una toxina bacteriana.

8. El método de la reivindicación 1, comprendiendo además: (f) purificar o aislar el ácido nucleico; y/o (g) detectar

el ácido nucleico, donde la detección resulta en la determinación de que el ácido nucleico es de un organismo que produce un agente biopeligroso.

9. El método de la reivindicación 8, donde el agente biopeligroso es una toxina bacteriana.

10. El método de la reivindicación 1, que comprende además purificar o aislar el ácido nucleico tras el paso (e) .

11. El método de la reivindicación 1, donde la muestra es una muestra no procesada, conservada, recién aislada, 45 bruta o no refinada.

12. El método de la reivindicación 1, donde la puesta en contacto en el paso (b) comprende la mezcla o agitación en vortex.

13. El método de la reivindicación 1, donde el aislamiento en el paso (c) comprende centrifugar el floculante y la muestra obtenidos en el paso (b) y recolectar un sobrenadante que comprende ácido nucleico.

14. El método de la reivindicación 1, que comprende además tras el paso (e) , detectar o caracterizar el ácido

nucleico, donde el ácido nucleico es un ácido nucleico purificado, aislado, amplificado o hibridado.

15. El método de la reivindicación 1, donde la muestra empleada en el paso (a) comprende un ácido nucleico extraído de una muestra biológica o ambiental donde el ácido nucleico aislado no arroja un producto de amplificación detectable en una reacción de amplificación, y opcionalmente la reacción de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , y que comprende además los pasos de: (f) purificar y/o amplificar el ácido nucleico.

16. El método de la reivindicación 15, donde la puesta en contacto en el paso (b) comprende la mezcla o agitación en vortex.

17. El método de la reivindicación 15, donde el aislamiento en el paso (c) comprende centrifugar el floculante y la 10 muestra obtenidos en el paso (b) y recolectar un sobrenadante que comprende ácido nucleico.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se emplea un kit que comprende: (a) un agente caotrópico; (b) acetato de amonio; (c) sulfato de amonio y aluminio o sulfato de amonio y aluminio dodecahidratado; (d) una o más soluciones o amortiguadores; opcionalmente (e) uno o más recipientes de tubo útiles para llevar a cabo el método; y (f) instrucciones que describen un método para su uso según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, donde el kit comprende además un detergente, donde opcionalmente el detergente se selecciona entre el grupo compuesto por dodecil-sulfato sódico (SDS) , sarkosyl, lauril sarcosinato de sodio, bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) , ácido cólico, ácido desoxicólico, benzamidotaurocolato (BATC) , octilfenol polietoxilato, monolaurato de sorbitán polioxietilenado, terc

octilfenoxi poli (oxietileno) etanol, polietilenglicol terc-octilfenil éter (Triton®X-100) , (1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) fenilpolietilenglicol (Triton®X-114) y una combinación de los mismos.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, donde el kit comprende además un material homogeneizante.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, donde el material homogeneizante comprende una perla.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 18, donde el kit comprende además uno o más oligonucleótidos o 25 nucleótidos libres.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, donde el kit comprende uno o más oligonucleótidos que hibridan específicamente con un ácido nucleico de un microorganismo, animal, planta, insecto, levadura, virus, fago, nematodo, bacteria u hongo.

24. El método de la reivindicación 23, donde el uno o más oligonucleótidos del kit hibridan específicamente con 30 un ácido nucleico de:

(a) un Bacillus spp., un Clostridium spp., un Sporolactobacillus spp., un Sporocarcina spp., un Filibacter spp., un Car y ophanum spp., un Desulfotomaculum spp., un Cor y nebacterium spp., un Micrococcus spp., un Mycobacterium spp., un Nocardia spp., un Peptococcus spp., un Peptostreptococcus spp.; o (b) un ácido nucleico de una bacteria Gram negativa seleccionada entre la familia compuesta por Acetobacteriaceae, Alcaligenaceae, Bacteroidaceae, Chromatiaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Neisseriaceae, Nitrobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Rickettsiaceae y Spirochaetaceae; o (c) un ácido nucleico de B. anthracis, A. globiformis, B. subtilis, C. renale, C. difficile, M. luteus, o R. 40 er y thropolis; o (d) un ácido nucleico de variola, varicela, reovirus, retrovirus, VIH, VIH-1, VIH-2, fiebre hemorrágica viral, Ebola, Marburg, Machupo, Lassa, Variola mayor o encefalitis viral.

25. El método de la reivindicación 22, donde el kit comprende uno o más oligonucleótidos y nucleótidos libres 45 suficientes para llevar a cabo una reacción de PCR, una replicación por círculo rodante, una reacción en cadena de la ligasa o una reacción de transcripción inversa.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 18, donde el kit comprende además al menos una enzima.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el kit incluye una polimerasa.

Dibujos

Figura 1

Figura 2

Figura Figura 4

Figura 5

Figura 6

Fragmento

Cebadores

Figura 7 Tipo de suelo 1 Tipo de suelo 2 Tipo de suelo 3

Volumen cargado

Volumen eluido Antes de purificación / Después de purificación

Figura 8 Controles Tipo de suelo 4 Tipo de suelo 5 Tipo de suelo 6

Volumen eluido

Figura

Figura 10

600 pb

Figura 11

1200 pb