Interacciones proteína-proteína en virus de inmunodeficiencia humana.

Polipéptido que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 128.

Interacciones proteína-proteína en virus de inmunodeficiencia humana

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a proteínas que interaccionan con proteínas del Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) . Más específicamente, la presente invención se refiere a complejos de polipéptidos o polinucleótidos que codifica los polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, anticuerpos para los complejos, Dominios de interacción seleccionados (SID®) que se identifican debido a las interacciones proteína-proteína, métodos para cribar fármacos para agentes que modulan la interacción de proteínas y composiciones farmacéuticas que son capaces de modular las interacciones proteína-proteína.

ANTECEDENTES Y ESTADO DE LA TÉCNICA

La mayoría de procesos biológicos implican interacciones proteína-proteína. Las interacciones proteínaproteína permiten la asociación de dos o más proteínas. Se forman un gran número de enlaces no covalentes entre las proteínas cuando se emparejan de manera precisa dos superficies de proteína. Estos enlaces justifican la especificidad de reconocimiento. De este modo, las interacciones proteína-proteína están implicadas, por ejemplo, en el ensamblaje de subunidades de enzimas, en el reconocimiento de anticuerpo-antígeno, en la formación de complejos bioquímicos, en el plegamiento correcto de proteínas, en el metabolismo de proteínas, en el transporte de proteínas, en la localización de proteínas, en el recambio de proteínas, en las modificaciones de la primera traducción, en las estructuras centrales de virus y en la transducción de señales.

Se han desarrollado metodologías generales para identificar proteínas de interacción o para estudiar estas interacciones. Entre estos métodos están el sistema de dos híbridos desarrollado originalmente por Filds y colaboradores y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.283.173, 5.468.614 y

5.667.973.

El sistema de dos híbridos más temprano y más simple, que actuaba como base para el desarrollo de otras versiones, es un ensayo in vivo entre dos proteínas construidas específicamente. La primera proteína, conocida en la técnica como la “proteína cebo” es una proteína quimérica que se une a un sitio en dirección 5’ de ADN de un gen informador mediante un dominio de unión a ADN o BD. Habitualmente, el dominio de unión es el dominio de unión a ADN de Gal4 o LexA de E. coli nativo y los sitios situados en dirección 5’ del informador son sitios de unión a Gal4 u operadores de LexA, respectivamente.

La segunda proteína también es una proteína quimérica conocida como “presa” (“prey”) en la técnica. Esta segunda proteína quimérica porta un dominio de activación o AD. Este dominio de activación deriva habitualmente de Gal4, de VP16 o de B42.

Además de los sistemas de dos híbridos, se han desarrollados otros sistemas mejorados para detectar interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, se desarrolló un sistema de dos híbridos más uno que permite la utilización de dos proteínas como cebo para cribar bibliotecas de ADNc disponibles para detectar un tercer miembro. Este método permite la detección entre proteínas que son parte de un complejo mayor de proteínas, tal como el holoenzima de ARN polimerasa II y los complejos TFIIH o TFIID. Por lo tanto, este método, en general, permite la detección de la formación de complejos ternarios, así como inhibidores que previenen la interacción entre las dos proteínas fusionadas definidas previamente.

Otra ventaja del sistema de dos híbridos más uno se que permite o previene la formación del activador transcripcional, dado que el tercer miembro se puede expresar a partir de un promotor condicional, tal como el promotor Mt25 reprimido en metionina que se regula positivamente en un medio que carece de metionina. La presencia del promotor regulado en metionina proporciona un control excelente para valuar las propiedades de activación o inhibición del tercer miembro debido a su intercambio “on” y “off” para la formación del activador transcripcional. Se describe el método de tres híbridos, por ejemplo, en Tirode et al., The Journal of Biological Chemistr y , 272, No. 37 pp. 22995-22999 (1997) .

Además de los sistemas de dos híbridos y dos híbridos más uno, otra variante es la que se describe en Vidal et al, Proc. Natl. Sci. 93 págs. 10315-10320 denominada los sistemas de dos y un híbrido invertidos en los que se puede cribar un grupo de moléculas que inhiben interacciones específicas proteína-proteína o proteína-ADN, respectivamente.

Un resumen de las metodologías disponibles para detectar interacciones proteína-proteína se describe en Vidal y Legrain, Nucleic Acids Research Vol. 27, No. 4 pgs. 919-929 (1999) y Legrain y Selig, FEBS Letters 480 pgs. 32-38 (2000) .

Sin embargo, las estrategias utilizadas habitualmente anteriores y especialmente los métodos de dos híbridos utilizados habitualmente presentan sus desventajas. Por ejemplo, se sabe en la técnica que, más a menudo que no, existen falsos positivos y falsos negativos en el método de cribado. De hecho, se ha desarrollado una doctrina en este campo para interpretar los resultados y en la práctica habitual se lleva a cabo en general una técnica adicional, tal como la coinmunoprecipitación o sedimentación por gradiente de los supuestos agentes interactuantes de la célula o tipo de tejido apropiado. Los métodos utilizados para interpretar los resultados se describen por Brent y Finley, Jr. in Ann. Rev. Genet, 31 pgs. 663-704 (1997) . De este modo, la interpretación de los datos es muy cuestionable utilizando los sistemas convencionales.

Un método para superar las dificultades halladas con los métodos en la técnica anterior se describe en WO99/42612. Este método es similar al sistema de dos híbridos descrito en la técnica anterior en que utiliza también polipéptidos “cebo” y “presa”. Sin embargo, la diferencia con este método es que se realiza una etapa de apareamiento de por lo menos una primera célula de levadura recombinante haploide que contiene el polipéptido presa a analizar con una segunda célula de levadura recombinante haploide que contiene el polipéptido cebo. Naturalmente, el experto en la materia entenderá que la primera células de levadura recombinante o la segunda célula de levadura recombinante contiene por lo menos un gen informador detectable que es activado por un polipéptido que incluye un dominio de activación transcripcional.

El método descrito en WO99/42612 permite el cribado de más polinucleótidos presa con un polinucleótido cebo determinado en una única etapa que en los sistemas de la técnica anterior debido a la estrategia de apareamiento de célula a célula entre células de levadura haploides. Además, este método es más meticuloso y reproducible, así como sensible. De este modo, la presencia de falsos negativos y/o falsos positivos es extremadamente mínimo en comparación con los métodos convencionales de la técnica anterior.

El agente etiológico del SIDA, en concreto el virus de inmunodeficiencia humano (VIH) , se descubrió en 1984 y actualmente existen pruebas fiables para el anticuerpo de VIH, así como del propio virus. El SIDA está causado por VIH, un retrovirus humano del grupo de lentivirus. Los cuatro retrovirus reconocidos pertenecen a dos grupos distintos; el retrovirus linfotrófico T humano (o leucemia) , tal como HTLV-I y HTLV-II o los virus de inmunodeficiencia humana, tales como VIH-1 y VIH-2. HTLV-I y HTLV-II son virus transformantes, mientras que VIH-1 y VIH-2 son virus citopáticos. La causa más común de SIDA en el mundo es el VIH-1. El VIH-2 está más estrechamente relacionado a algunos miembros de virus de inmunodeficiencia en simios y tiene aproximadamente el 40% de identidad desecuencia con VIH-1. El VIH-2 se ha identificado predominantemente en el oeste de África y se cree que es menos patogénico que el VIH-1.

VIH-1 tiene los genes retrovirales habituales, tales como env, gal y pol. El gen gag codifica las proteínas de núcleo del virión precursor para la proteína de matriz (MA) , la proteína de la cápside (CA) , la proteína de la nucleocápside (NC) y P6. El gen pol codifica el precursor para varias enzimas del virión, tales como proteasa (PR) , transcriptasa inversa (RT) , ARNasa H e integrasa (IN) . El gen env codifica los precursores para la glicoproteína de la envoltura (Env gp) , tal como la glicoproteína de superficie (gp 120/SU) y la proteína transmembrana (gp 41/TM) .

Los genes de transactivador transcripcional (tat) y regulador de la expresión viral (rev) son codificados cada... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 128.

2. Variante del polipéptido, según la reivindicación 1, en la que dicha variante es por lo menos el 95, 0% idéntica a la SEQ ID NO: 128, calculada mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch.

3. Polipéptido que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 40.

4. Variante del polipéptido, según la reivindicación 3, en la que dicha variante es por lo menos el 95, 0% idéntica a la SEQ ID NO: 40, calculada mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch.

5. Polinucleótido que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 127 o la secuencia SEQ ID NO: 17.

6. Variante del polinucleótido, según la reivindicación 5, en la que dicha variante es por lo menos el 95, 0% idéntica a la SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 17, calculada mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch.

7. Variante del polinucleótido, según la reivindicación 5, en la que dichos cambios de nucleótidos son silenciosos y no alteran la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido tal como se define en las SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 17.

8. Vector recombinante que consiste en una secuencia de polinucleótidos de VIH-1 o Transportina-SR, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, y los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia de polinucleótidos de VIH-1 o Transportina-SR.

9. Célula huésped recombinante que contiene el vector recombinante, según la reivindicación 8.

10. Composición que comprende el vector, según la reivindicación 8, o la célula huésped recombinante, según la reivindicación 9.

11. Composición farmacéutica que comprende el polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y opcionalmente, un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

12. Composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un vector recombinante, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, opcionalmente un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

13. Composición farmacéutica, según la reivindicación 12, en la que dicho vector incluye la secuencia de nucleótidos tal como se define en la SEQ ID NO:17.

14. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para utilizar en el tratamiento o prevención del SIDA en un humano o mamífero.

15. Composición farmacéutica, según la reivindicación 11, para utilizar en el tratamiento o prevención del SIDA en un mamífero, en la que dicho polipéptido es un polipéptido tal como se define en la SEQ ID NO: 40 o una variante que tiene por lo menos el 95, 0% de identidad con la SEQ ID NO: 40.

16. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para utilizar en la inhibición de la replicación del VIH en células sensibles a la infección por VIH.

17. Utilización de un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para cribar moléculas que inhiben el virus de inmunodeficiencia humano del tipo 1.

18. Complejo entre la integrasa de VIH y la Transportina-SR, en el que la integrasa de VIH presenta un dominio de interacción seleccionado que tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 128, y la Transportina-SR tiene un dominio de interacción seleccionado que tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 40.

19. Complejo entre la integrasa de VIH y la Transportina-SR, según la reivindicación 18, en el que el dominio de interacción seleccionado de la integrasa de VIH comprende una secuencia que es por lo menos el 95, 0% idéntica a la SEQ ID NO: 128.

20. Complejo entre la integrasa de VIH y la Transportina-SR, según la reivindicación 18 ó 19, en el que el dominio de interacción seleccionado de la Transportina-SR comprende una secuencia que es por lo menos el 95, 0% idéntica a la SEQ ID NO: 40.

21. siARN dirigido contra el gen de transportina-SR para utilizar en el tratamiento de la infección por VIH-1.

22. Utilización de un complejo, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, para aislar las moléculas anti-VIH capaces de alterar la interacción transportina-SR/integrasa.

23. Utilización de un polipéptido, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para cribar moléculas que inhiben el virus de inmunodeficiencia humano.