Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor.

Un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:**Fórmula**

Inhibidores de fluorescencia oscuros para transferencia de energía donador-aceptor Antecedentes de la invención

Hay una necesidad continua y en expansión de métodos rápidos, altamente específicos de detección y cuantificación de sustancias químicas, bioquímicas y biológicas como analitos en mezclas de investigación y diagnóstico. De particular valor son los métodos para medir pequeñas cantidades de ácidos nucleicos, péptidos, productos farmacéuticos, metabolitos, microorganismos y otros materiales de valor diagnóstico. Los ejemplos de tales materiales incluyen narcóticos y venenos, fármacos administrados para propósitos terapéuticos, hormonas, microorganismos y virus patogénicos, anticuerpos, y enzimas y ácidos nucleicos, particularmente aquellos implicados en estados de la enfermedad.

La presencia de un analito particular puede a menudo determinarse por métodos de unión que explotan el alto grado de especificidad, que caracteriza muchos sistemas bioquímicos y biológicos. Los métodos que se usan frecuentemente se basan, por ejemplo, en sistemas antígeno-antlcuerpo, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos, y sistemas proteína- ligando. En estos métodos, la existencia de un complejo de valor diagnóstico se indica típicamente por la presencia o ausencia de una "etiqueta" observable que se une a uno o más de los materiales que interactúan. El método específico de etiquetado escogido frecuentemente dicta la utilidad y versatilidad de un sistema particular para detectar un analito de interés. Las etiquetas preferidas son económicas, seguras y capaces de unirse eficientemente a una amplia variedad de materiales químicos, bioquímicos y biológicos sin alterar significativamente las características de unión importantes de estos materiales. La etiqueta debe dar una señal altamente característica, y debe encontrarse raramente, y preferentemente nunca, en la naturaleza. La etiqueta debe ser estable y detectable en sistemas acuosos en períodos de tiempo en el intervalo de hasta meses. La detección de la etiqueta es preferentemente rápida, sensible, y reproducible sin la necesidad de instalaciones caras, especializadas o la necesidad de precauciones especiales para proteger al personal. La cuantificación de la etiqueta es preferentemente relativamente independiente de variables tales como la temperatura y la composición de la mezcla que se ensaya.

Se han desarrollado una amplia variedad de etiquetas, cada una con ventajas y desventajas particulares. Por ejemplo, las etiquetas radioactivas son bastante versátiles, y pueden detectarse a muy bajas concentraciones, tales etiquetas son, sin embargo, caras, peligrosas, y su uso requiere equipamiento sofisticado y personal entrenado. Así, hay un amplio interés en las etiquetas no-radioactivas, particularmente en las etiquetas que son observables por técnicas espectrofotométricas, de resonancia de spin, y de luminiscencia, y materiales reactivos tales como enzimas que producen tales moléculas.

Las etiquetas que se detectan por medio del uso de espectroscopia de fluorescencia son de particular interés, debido al gran número de tales etiquetas que se conocen en la técnica. Además, la literatura está repleta de síntesis de etiquetas fluorescentes derivatizados para permitir su fácil unión a otras moléculas, y muchas de tales etiquetas fluorescentes están comercialmente disponibles.

Además de detectarse directamente, muchas etiquetas fluorescentes operan para apagar la fluorescencia de una etiqueta fluorescente adyacente secundaria. Debido a su dependencia de la distancia y la magnitud de la interacción entre el inhibidor de fluorescencia y el fluoróforo, la inhibición de la fluorescencia de las especies fluorescentes proporciona una sonda sensible de configuración molecular y unión, u otras, interacciones. Un ejemplo excelente del uso de pares reportero fluorescente inhibidor de fluorescencia se encuentra en la detección y análisis de ácidos nucleicos.

Las sondas de ácidos nucleicos fluorescentes son herramientas importantes para el análisis genético, en la investigación y el desarrollo genéticos, y en la medicina clínica. A medida que se acumula la información del Proyecto del Genoma Humano, el nivel de interrogación genética mediada por sondas fluorescentes se expanderá enormemente. Una clase de sondas fluorescentes particularmente útiles incluyen sondas de auto-apagado, además conocidas como sondas de transferencia de energía de fluorescencia, o sondas FET. El diseño de diferentes sondas por medio del uso de estos motivos puede variar en detalles. En una sonda FET ilustrativa, ambos un fluoróforo y un inhibidor de fluorescencia están atados a ácidos nucleicos. La sonda se configura de forma tal que el fluoróforo está próximo al inhibidor de fluorescencia y la sonda produce una señal solamente como resultado de su hibridación a un objetivo previsto. A pesar de la disponibilidad limitada de sondas FET, las técnicas que incorporan su uso desplazan rápidamente los métodos alterativos.

Las sondas que contienen un par fluoróforo-inhibidor de fluorescencia se desarrollaron para ensayos de hibridación de ácidos nucleicos donde la sonda forma una estructura de horquilla, es decir, donde la sonda se híbrida consigo misma para formar un bucle de forma que la molécula inhibidora de fluorescencia se acerca a la molécula reportera en ausencia de una secuencia de ácidos nucleicos complementaria para prevenir la formación de la estructura de horquilla (ver, por ejemplo, documento WO 90/03446; solicitud de patente europea núm. 0 601 889 A2). Cuando está presente una secuencia objetivo

complementaria, la hibridación de la sonda a la secuencia objetivo complementaria interrumpe la estructura de horquilla y provoca que la sonda adopte una configuración donde la molécula Inhibidor de fluorescencia ya no está suficientemente cerca de la molécula reportera para inhibir la fluorescencia de la molécula reportera. Como resultado, las sondas proporcionan una señal de fluorescencia mayor cuando se hibridan a una secuencia objetivo que cuando están sin hlbrldar.

Se han desarrollado ensayos para detectar una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada y para Identificar la presencia de una estructura de horquilla por medio del uso de dos sondas separadas, una que contiene una molécula reportera y la otra una molécula inhibidora de fluorescencia (ver, Merlngue, y otros, Nuclelc Aclds Research, 22: 920-928 (1994)). En estos ensayos, la señal de fluorescencia de la molécula reportera disminuye cuando se híbrida a la secuencia objetivo debido a que la molécula inhibidora de fluorescencia se aproxima a la molécula reportera.

Una aplicación particularmente Importante para las sondas que Incluyen un par de moléculas reportera-inhibidor de fluorescencia es su uso en las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, tales como las reacciones en cadena de la pollmerasa (PCR), para detectar la presencia y amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos objetivo. En general, las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos han abierto amplios nuevos enfoques para las pruebas genéticas y el análisis de ADN (ver, por ejemplo, Arnhelm y otros. Ann. Rev. Blochem., 61: 131-156 (1992)). La PCR, en particular, se ha convertido en una herramienta de Investigación de gran Importancia con aplicaciones en, por ejemplo, el clonaje, análisis de expresión genética, secuenciación de ADN, mapeo genético y descubrimiento de fármacos (ver, Arnheim y otros, supra\ Gilliland y otros, Proc. Nati. Acad. Sel. USA, 87: 2725-2729 (1990);Bevan y otros, PCR Methods and Applications, 1: 222- 228 (1992); Green y otros, PCR Methods and Applications, 1: 77-90 (1991); Blackwell y otros, Science, 250: 1104-1110 (1990)).

Los métodos que se usan comúnmente para detectar los productos de amplificación de ácidos nucleicos requieren que el producto amplificado se separe de los Iniciadores sin reaccionar. Esto se logra típicamente ya sea mediante el uso de geles de electroforesis, que separan los productos de la amplificación sobre la base de una diferencia de tamaño, o mediante la Inmovilización del producto, lo que permite lavar el iniciador libre. Sin embargo, se han descrito un número de métodos para supervisar el proceso de amplificación sin una separación previa del iniciador. Todos ellos se basan en FET, y ninguno de ellos detecta el producto amplificado directamente. En lugar de esto, los métodos detectan algunos eventos relacionados con la amplificación. Por esa razón, se acompañan de problemas de alto fondo, y no son cuantitativos, como se discute más abajo.

Un método, descrito en Wang y otros (patente de los Estados Unidos núm.. 5,348,853; y Anal. Chem., 67: 1197-1203 (1995)), usa un sistema de... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:

2. Un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:

3. Un compuesto que tiene una estructura seleccionada de:

Un microarreglo que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

y

en donde dicho compuesto se conjuga directamente con un soporte sólido o con una molécula portadora unida a dicho soporte sólido.

Una mezcla que comprende al menos una primera molécula portadora y una segunda molécula portadora:

en donde dicha primera molécula portadora está enlazada covalentemente a un primer compuesto, el primer compuesto es un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

y

en donde dicha segunda molécula portadora está enlazada covalentemente a un segundo compuesto, el segundo compuesto es un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

Un método para detectar o cuantlficar especies moleculares, dicho método comprende:

poner en contacto dichas especies moleculares con una mezcla de acuerdo con la reivindicación 5; y detectar un cambio en una propiedad fluorescente de un componente de dicha mezcla, dichas especies moleculares y una combinación de estas, y de ese modo detectar o cuantificar dichas especies moleculares.

Un método para determinar si una muestra contiene una enzima, dicho método comprende:

(a) poner en contacto dicha muestra con un constructo peptídico que comprende

i) un fluoróforo;

ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

OH

o2n

OH

H3CO

y

S

OH

y

¡ü) un sitio de reconocimiento de la escisión para dicha enzima,

en donde dicho péptido está en una configuración que permite la transferencia de energía donador-aceptor entre dicho fluoróforo y dicho inhibidor de la fluorescencia cuando dicho fluoróforo se excita;

(b) excitar dicho fluoróforo; y

(c) determinar una propiedad de fluorescencia de dicha muestra, en donde la presencia de dicha enzima en dicha muestra resulta en un cambio en dicha propiedad de fluorescencia.

Un método para determinar si un compuesto altera una actividad de una enzima, dicho método comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende dicha enzima y dicho compuesto con un constructo peptídico que comprende

i) un fluoróforo;

ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

OH

H3CO

y

OH

y

¡ü) un sitio de reconocimiento de la escisión para dicha enzima,

en donde dicho péptido está en una configuración que permite la transferencia de energía donador-aceptor entre dicho fluoróforo y dicho compuesto cuando dicho fluoróforo se excita;

(b) excitar dicho fluoróforo; y

(c) determinar una propiedad de fluorescencia de dicha muestra, en donde dicha actividad de dicha enzima en dicha muestra resulta en un cambio en dicha propiedad de fluorescencia.

Un método para detectar una secuencia objetivo de ácido nucleico, dicho método comprende:

(a) poner en contacto dicha secuencia objetivo con un ácido nucleico detector que comprende una secuencia de unión objetivo monocatenaria, dicho ácido nucleico detector está enlazado a ella,

i) un fluoróforo; y

ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

H3CO

y

en donde dicho ácido nucleico detector está en una configuración que permite la transferencia de energía donador aceptor entre dicho fluoróforo y dicho compuesto cuando dicho fluoróforo se excita;

(b) hibridar dicha secuencia de unión objetivo a dicha secuencia objetivo, y de ese modo alterar dicha configuración de dicho ácido nucleico detector, causando un cambio en un parámetro de fluorescencia; y

(c) detectar dicho cambio en dicho parámetro de fluorescencia, y de ese modo detectar dicha secuencia objetivo de ácido nucleico.

Un método para detectar la amplificación de una secuencia objetivo que comprende, en una reacción de amplificación :

(a) hibridar a dicha secuencia objetivo un ácido nucleico detector que comprende una secuencia de unión objetivo monocatenaria y una estructura secundaria intramolecularmente asociada 5' a dicha secuencia de unión objetivo, en donde al menos una porción de dicha secuencia detectara forma una cola monocatenaria que está disponible para la hibridación a dicha secuencia objetivo, dicho oligonucleótido detector tiene unido a él,

i) un fluoróforo; y

ii) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

y

en donde dicho ácido nucleico detector está en una configuración que permite la transferencia de energía donador aceptor entre dicho fluoróforo y dicho compuesto cuando dicho fluoróforo se excita;

(b) extender dicho ácido nucleico detector hibridado en dicha secuencia objetivo con una polimerasa para producir un producto de extensión de ácido nucleico detector y separar dicho producto de extensión de ácido nucleico detector de dicha secuencia objetivo;

(c) hibridar un iniciador a dicho producto de extensión de ácido nucleico detector y extender el iniciador con dicha polimerasa, y de ese modo linealizar dicha estructura secundaria intramolecularmente asociada y producir un cambio en un parámetro de fluorescencia; y

(d) detectar dicho cambio en dicho parámetro de fluorescencia, y de ese modo detectar dicha secuencia objetivo.

Un método de la reivindicación 9 o la reivindicación 10 en donde el ácido nucleico es un oligonucleótido.

Un método para determinar si un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico hibridan, dicho primer ácido nucleico comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

y

covalentemente unido a dicho ácido nucleico, dicho método comprende:

(a) poner en contacto dicho primer ácido nucleico con dicho segundo ácido nucleico;

(b) detectar una alteración en una propiedad fluorescente de un elemento seleccionado de dicho primer ácido nucleico, dicho segundo ácido nucleico y una combinación de estos, y de ese modo determinar si ocurre la hibridación.

Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que está covalentemente unido a: una molécula pequeña con un peso molecular de menos de 1000 dalton, una proteína, un péptido, un polímero sintético o un soporte sólido.

Una sonda que incluye un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene una fórmula seleccionada de

conjugado a un receptor, una enzima, un ligando para una especie objetivo que es un ácido nucleico o un péptido, o a una molécula pequeña con un peso molecular de menos de 1000 dalton.

Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un conjugado que comprende uno o más de dichos compuestos inmovilizados en un polímero, biomolécula o material sólido o semisólido que tenga cualquier configuración útil.

Una especie que contiene un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y dentro de una matriz acrilamida.

Un método para probar un microarreglo para la presencia de un compuesto, el método incluye:

(a) poner en contacto el microarreglo con una sonda que interactúa con el compuesto, la sonda incluye un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un compuesto que tiene la fórmula seleccionada de

OH

H3CO

y

OH

OH

H3CO

y

y

(b) detectar una diferencia en una propiedad de fluorescencia de un elemento seleccionado de la sonda, el compuesto y combinaciones de estos, y de ese modo determinar la presencia del compuesto.