Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas.

Una composición, que comprende un primer vector que contiene un polinucleótido que codifica una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada,

en donde dicho polinucleótido está mutado en los codones que codifican el aminoácido en las posiciones de la secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natu

Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas Declaración de interés del gobierno Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno federal bajo el número de concesión GM62523, otorgado por el NIH. El gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención La ingeniería de proteínas es una potente herramienta para la modificación de las propiedades catalíticas estructurales y de unión de proteínas naturales y para el diseño de novo de proteínas artificiales. La ingeniería de proteínas se basa en un mecanismo de reconocimiento eficiente para la incorporación de aminoácidos mutantes en las secuencias de proteínas deseadas. Aunque este proceso ha sido muy útil para el diseño de nuevas macromoléculas con un control preciso de la composición y la arquitectura, una limitación importante es que la mutagénesis está restringida a los 20 aminoácidos que se producen de forma natural. Sin embargo, cada vez es más evidente que la incorporación de aminoácidos no naturales puede ampliar el alcance y el impacto de los métodos de ingeniería de proteínas.

Los aminoácidos no naturales que portan una amplia diversidad de nuevos grupos funcionales han sido reemplazados globalmente para el reemplazo o la incorporación específica para el residuo en proteínas recombinantes. La asimilación biosintética de aminoácidos no canónicos en proteínas se ha logrado en gran medida explotando la capacidad del aparato de síntesis de tipo salvaje de utilizar análogos de aminoácidos de origen natural (Budisa 1995, Eur. J. Biochem 230: 788-796; Deming 1997, J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem A34; 2143-2150; Duewel 1997, Biochemistr y 36: 3404-3416; van Hest y Tirrell 1998, FEBS Lett 428 (1-2) : 68-70; Sharma et al, 2000, FEBS Lett 467 (1) : 37-40.) . Sin embargo, hay situaciones en las que se requiere la sustitución o incorporación en un solo sitio de aminoácidos no naturales. Una metodología de este tipo permitiría la adaptación en una proteína (el tamaño, la acidez, nucleofilicidad, enlaces hidrógeno o propiedades hidrófobas, etc. de aminoácidos) para cumplir una propiedad estructural o funcional específica de interés. La capacidad de incorporar de modo específico para el sitio tales análogos de aminoácidos en proteínas ampliaría en gran medida nuestra capacidad de manipular de forma racional y sistemática las estructuras de proteínas, tanto para investigar la función de proteínas como para crear proteínas con nuevas propiedades. Por ejemplo, la capacidad de sintetizar grandes cantidades de proteínas que contienen átomos pesados facilitaría la determinación de la estructura de las proteínas, y la capacidad de sustituir de modo específico para el sitio fluoróforos o grupos foto-escindibles en proteínas en células vivas proporcionaría potentes herramientas para el estudio de las funciones de proteínas in vivo.

En los últimos años, varios laboratorios han llevado a cabo una expansión en el número de aminoácidos codificados genéticamente, utilizando un supresor sin sentido o un ARNt supresor del desplazamiento del marco para incorporar aminoácidos no canónicos en proteínas en respuesta a codones ámbar o de cuatro bases , respectivamente (Bain et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 8013, 1989; Noren et al., Science 244: 182, 1989; Furter, Protein Sci. 7: 419, 1998; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 56, 2003; Hohsaka et al., FEBS Lett. 344:

171: 1994; Kowal y Oliver, Nucleic Acids Res. 25: 4685, 1997) . Tales métodos insertan aminoácidos no canónicos en posiciones del codón que normalmente terminarán la síntesis de péptidos de tipo salvaje (p. ej., un codón de terminación o una mutación de desplazamiento del marco) . Estos métodos han funcionado bien para la inserción en un solo sitio de nuevos aminoácidos. Sin embargo, su utilidad en la sustitución o incorporación específica para la posición en múltiples sitios (frente a específica para residuos) está limitada por modestas eficacias de supresión (20-60%) (Anderson et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9674, 2002; Bain et al., Nature 356: 537, 1992; Hohsaka et al., Nucleic Acids Res. 29: 3646, 2001) . Esto es así, en parte debido a que una eficacia de supresión demasiado alta del codón de terminación interferirá con la terminación normal de la traducción de algunas proteínas no fijadas como objetivo en el organismo. Por otra parte, una baja eficacia de supresión será probablemente insuficiente para suprimir más de un sitio sin sentido o de mutación de desplazamiento del marco en la proteína diana, de tal manera que se hace más y más difícil o poco práctico sintetizar una proteína diana de longitud completa incorporando más y más aminoácidos no canónicos.

Una incorporación eficaz en múltiples sitios se ha logrado mediante la sustitución de aminoácidos naturales en cepas auxotróficas de Escherichia coli, por ejemplo utilizando aminoacil-ARNt sintetasas con especificidad relajada para el sustrato o actividad de edición alterada (Wilson y Hatfield, Biochim. Biophys. Acta 781: 205, 1984; Kast y Hennecke, J. Mol. Biol. 222: 99, 1991; lbba et al., Biochemistr y 33:. 7107, 1994; Sharma et al., FEBS Lett. 467: 37, 2000; Tang y Tirrell, Biochemistr y 41: 10635, 2002; Datta et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 5652, 2002; Doring et al., Science 292: 501, 2001) . Aunque este método proporciona una incorporación eficaz de análogos en múltiples

sitios, adolece de la limitación de que los nuevos aminoácidos deben "compartir" codones con uno de los aminoácidos naturales. Así, para cualquier posición del codón dada en la que se puedan insertar aminoácidos tanto naturales como nuevos, con excepción de una probabilidad de incorporación, hay relativamente poco control sobre qué aminoácido terminará siendo insertado. Esto puede ser indeseable, ya que para una enzima o proteína modificada, la incorporación no canónica de aminoácidos en un sitio no pretendido puede comprometer de forma inesperada la función de la proteína, mientras que omitir la incorporación del aminoácido no canónico en el sitio diseñado fracasará en lograr el objetivo de diseño.

En general, métodos de sustitución en múltiples sitios son relativamente simples de llevar a cabo, pero están reemplazados todos los sitios correspondientes a un aminoácido natural particular a lo largo de la proteína. El grado de incorporación del aminoácido natural y no natural también puede variar. Además de ello, la incorporación de múltiples sitios de análogos resulta, a menudo, en toxicidad cuando se utilizan células, lo que hace difícil estudiar la proteína mutante en células vivas. La presente invención supera estos obstáculos al permitir una mutación específica para el sitio de aminoácidos en proteínas.

Determinadas realizaciones descritas en esta memoria proporcionan una nueva técnica para la incorporación de aminoácidos de sustitución, incluidos aminoácidos de origen natural o aminoácidos no estándares o no canónicos, en proteínas que se basa en romper la degeneración del código genético. Específicamente, determinadas realizaciones en esta memoria permiten una sustitución específica para la posición de alta fidelidad o la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas.

El documento US2004/0053390 Datta et al.) describe métodos, reactivos y herramientas computacionales para diseñar análogos de sustrato no naturales para enzimas, especialmente para diseñar análogos de aminoácidos no naturales para aminoacil-ARNt sintetasas tal como la Phe-ARNt sintetasa.

Breve sumario de la invención Determinadas realizaciones descritas en esta memoria proporcionan composiciones de componentes utilizados en la maquinaria biosintética de proteínas, que incluyen moléculas de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS – siglas en inglés) mutantes externas, opcionalmente emparejadas con moléculas de aminoacil-ARNt mutantes externas.

También se proporcionan métodos para la generación y selección de ARNts mutantes externos, aminoacil-ARNt sintetasas mutantes externas, y pares de los mismos, que son capaces de incorporar aminoácidos, incluidos aminoácidos no naturales, en polipéptidos o proteínas. Determinadas composiciones de formas de realización específicas incluyen nuevos pares de ARNt mutante externo o aminoacil-ARNt mutante externo. Las nuevas moléculas de ARNt, moléculas de AARS mutantes externas, o pares de AARS-ARNt mutantes externos se pueden utilizar para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido in vitro e in vivo. Otras realizaciones de la invención incluyen la selección de pares de mutantes externos.

Composiciones de la presente invención incluyen una aminoacil-ARNt sintetasa mutante... [Seguir leyendo]

1. Una composición, que comprende un primer vector que contiene un polinucleótido que codifica una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicho polinucleótido está mutado en los codones que codifican el aminoácido en las posiciones de la secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural.

2. La composición de la reivindicación 1, que comprende, además, un segundo vector que contiene un polinucleótido que codifica una molécula de ARNt modificada.

3. La composición de la reivindicación 2, en donde dichos primer y segundo vectores son el mismo vector.

4. La composición de la reivindicación 2, en donde dichos primer y segundo vectores son vectores diferentes.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicho ARNt está modificado de manera que contiene un anticodón mutado que forma pares de bases con un correspondiente codón degenerado por bamboleo con una afinidad mayor que la afinidad del ARNt natural.

6. Un polipéptido que comprende una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicha sintetasa modificada está mutada en las posiciones de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural.

7. Un sistema de traducción que comprende un polinucleótido que codifica una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicho polinucleótido de sintetasa modificada está mutado en uno o más codones que codifican el aminoácido en las posiciones de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural.

8. El sistema de traducción de la reivindicación 7, en donde dicho sistema comprende una célula huésped.

9. El sistema de traducción de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende, además, un polinucleótido que codifica una molécula de ARNt modificada.

10. El sistema de traducción de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicho ARNt está modificado de manera que contiene un anticodón mutado que forma pares de bases con un correspondiente codón degenerado por bamboleo con una afinidad mayor que la afinidad del ARNt natural.

11. El sistema de traducción de la reivindicación 10, en donde el ARNt modificado es ARNtPhe equipado con el anticodón AAA.

12. El sistema de traducción de la reivindicación 8, en donde dicha PheRS modificada y/o dicha molécula de ARNt modificada se deriva de un organismo diferente de la célula huésped.

13. El sistema de traducción de la reivindicación 12, en donde dicha molécula de ARNt modificada se deriva de una célula eucariótica, y la célula huésped es una célula procariótica.

14. El sistema de traducción de la reivindicación 8, en donde la célula huésped es un auxótrofo.

15. El sistema de traducción de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, que comprende un medio de cultivo que contiene uno o más aminoácidos no naturales.

16. Un método para incorporar al menos un aminoácido no natural en un polipéptido diana en una o más ubicaciones especificadas, compendiendo el método proporcionar un sistema de traducción que contiene al menos un aminoácido no natural; proporcionar al sistema de traducción una o más fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicha sintetasa modificada está mutada en las posiciones de la secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural, proporcionar al sistema de traducción un polinucleótido que codifica un polipéptido diana de interés y permitir la traducción del polipéptido diana de interés, incorporando con ello al menos un aminoácido no natural en el polipéptido diana.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha molécula de ARNt se modifica de manera que contiene un anticodón mutado que forma pares de bases con un correspondiente codón degenerado por bamboleo con una afinidad mayor que la afinidad del ARNt natural.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en el que el sistema de traducción comprende una célula huésped, la molécula de ARNt se modifica, y en el que dicha PheRS modificada y/o dicha molécula de ARNt modificada se deriva de un organismo diferente a la célula huésped.

19. Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la sintetasa modificada está mutada de manera que los codones que codifican los aminoácidos en las posiciones 412, 415 y 437 están mutados.

20. Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la sintetasa modificada está mutada de manera que los codones que codifican los aminoácidos en las posiciones 415, 418 y 437 están mutados.

21. Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la sintetasa modificada está mutada de manera que los codones que codifican los aminoácidos en las posiciones 412, 415, 418 y 437 están mutados.

22. Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 ó 16, en donde dicha PheRS modificada utiliza un codón de terminación ámbar para la incorporación de un aminoácido no natural en una ubicación particular en el polipéptido.

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