Hialuronidasa extracelular de Streptomyces koganeiensis.

La hialuronidasa de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 que comprende la secuencia de aminoácidos Nterminal mostrada en SEQ ID Nº 1 y que tiene un peso molecular de 21,

6 kDa, un punto isoeléctrico (pI) que oscila de 4,4 a 4,8 y una actividad enzimática igual o mayor que 40.000 U.I./mg.

Hialuronidasa extracelular de Streptomyces koganeiensis Estado de la técnica

La hialuronidasa es una enzima hidrolítica que escinde ácido hialurónico hasta ácido D-glucurónico y N- acetilglucosamina; de manera variable, también es capaz de degradar otros mucopolisacáridos ácidos del tejido conectivo. Por ejemplo, se hallan concentraciones elevadas de hialuronidasa en el aparato bucal de sanguijuelas, en los venenos de serpientes, abejas, escorpiones y en los sobrenadantes de cultivos de bacterias patógenas tales como neumococos, estreptococos (3-hemolíticos y Staphylococcus aureus. En el cuerpo humano, la hialuronidasa se halla en la córnea, el cuerpo ciliar, bazo, piel y testículos. También se hallan cantidades elevadas de hialuronidasa en los espermatozoides, lo que les permite atravesar la barrera de ácido hialurónico que protege a los óvulos.

La hialuronidasa se usa en medicina en el tratamiento del edema, los estados inflamatorios locales, las hemorroides y los sabañones, y para facilitar la administración subcutánea de algunos ingredientes activos. También se informó de que algunas hialuronidasas son capaces de producir una reducción significativa del tamaño del infarto de miocardio [1]. En el campo veterinario, se usa en disoluciones de antibióticos para el tratamiento de enfermedades animales, tales como la mastitis bovina. Además, la hialuronidasa se puede usar como reactivo analítico en algunos ensayos biológicos, por ejemplo en la determinación cuali-cuantitativa de ácido hialurónico.

La producción y purificación a escala industrial de hialuronidasas bacterianas o animales es difícil debido al hecho de que la enzima se hace inestable en disolución acuosa y pierde actividad tras la purificación.

El documento US 4.258.134 y la patente europea correspondiente EP 5 751 [2] describen una hialuronidasa obtenida mediante diálisis y cromatografía de intercambio iónico con DEAE- y CM-celulosa del sobrenadante de cultivo de Streptomyces koganeiensis ATCC 31399.

Ahora se ha descubierto que tal fracción de proteínas, obtenida tras las dos etapas de cromatografía, está constituida de hecho por numerosos componentes proteicos (alrededor de 68 en una electroforesis bidimensional), pero solamente uno de ellos tiene una actividad de hialuronidasa elevada y una estabilidad notable.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a la hialuronidasa de Streptomyces koganeiensis ATCC 31399 que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal mostrada en SEQ ID N° 1, y que tiene un peso molecular de 21,6 kDa, un punto Isoeléctrico (pl) que oscila entre 4,4-4,8 y una actividad enzimática igual o mayor que 4. U.l./mg.

La hialuronidasa según la Invención se puede obtener mediante un proceso que incluye las etapas siguientes:

a) someter al sobrenadante obtenido de la fermentación de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 a cromatografía de intercambio catiónico débil y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa;

b) someter a la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa obtenida en la etapa a) a diafiltración y cromatografía de Intercambio anlónlco fuerte y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa;

c) someter a la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa obtenida en la etapa b) a cromatografía de Intercambio catiónico fuerte y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa;

d) someter a la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa obtenida en la etapa c) a cromatografía de Intercambio anlónlco fuerte y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa.

La fermentación del microorganismo se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos, en particular el método descrito en el documento US 4.258.134. El sobrenadante obtenido tras la fermentación se recoge, se centrifuga y se filtra. Además, antes de someterlo a las etapas de cromatografía según la invención, el sobrenadante se puede someter a tratamientos adicionales dirigidos a eliminar las partículas residuales del cultivo, mediante métodos y técnicas conocidas para la persona experta. Normalmente, el sobrenadante centrifugado y filtrado se somete a concentración y diálisis. En general, la concentración se lleva a cabo mediante ultrafiltración en filtros adecuados de polletersulfona con umbrales que oscilan entre 5 y 15 kDa, preferiblemente de 1 kDa; normalmente, el sobrenadante se concentra de 8 a 12 veces, preferiblemente 1 veces. Una vez que se verifica la presencia de la actividad de hialuronidasa mediante un ensayo adecuado, por ejemplo el ensayo modificado de Dorfman [3], el sobrenadante concentrado se dializa con una disolución tampón que se elige dependiendo de la resina de Intercambio catiónico débil usada en la etapa a), de tal manera que la hialuronidasa está en tales condiciones de pH que puede unirse a la resina; esta resina comprende grupos de Intercambio de carboxialqullo, preferiblemente grupos carboxlmetllo, tal como la resina "CM-Sepharose® Fast Flow". Después de equilibrar de manera adecuada la resina con la misma disolución tampón en la que se llevó a cabo la diálisis, se carga la muestra y después se lleva a cabo la elución con la misma disolución para eliminar las proteínas sin unir, tras lo cual se Incrementa el pH para eluir las proteínas unidas. Cuando se usa la resina "CM-Sepharose® Fast Flow", se lleva a cabo la diálisis, el equilibrado de la resina y la elución de las proteínas sin unir con una disolución de acetato sódico 5 mM a pH 4,,

mientras la elución de las proteínas unidas se lleva a cabo con una disolución de acetato sódico 5 mM a pH 4,5. Las proteínas unidas que exhiben una actividad elevada de hialuronidasa se mezclan en una única fracción y se someten a cromatografía de intercambio aniónico fuerte [etapa b)]. Antes de continuar, las fracciones mezcladas se aclaran mediante diafiltraclón, que se lleva a cabo mediante medios y métodos conocidos para la persona experta, con el uso de una disolución tampón que permite que la hialuronidasa se una a la resina de intercambio aniónico fuerte usada en la etapa b). Tal resina comprende grupos trialquilamonio, en general grupos trimetilamonio, tal como la resina HITrap® Q XL (columna de 5 mi). Después de equilibrar la resina con la misma disolución usada para la diafiltraclón, la fracción obtenida en la etapa a) se carga y después se lleva a cabo la elución con la misma disolución para eliminar las proteínas sin unir; después, la fuerza iónica del eluyente se incrementa progresivamente para elulr las proteínas unidas. Según una realización preferida, se usa la resina HiTrap® Q XL y la diafiltración, el equilibrado de la columna y la elución de las proteínas sin unir se llevan a cabo con una disolución tampón Tris-HCI 5 mM a pH 8, mientras la elución de las proteínas unidas se lleva a cabo añadiendo NaCI a concentraciones crecientes al eluyente. Al elulr primero con Tris-HCI 5 mM, disolución de NaCI 35 mM a pH 8 y después Tris-HCI 5 mM, disolución de NaCI 2 mM a pH 8, se obtienen dos fracciones, y solamente la segunda, eluida con la disolución que contiene NaCI 2 mM, exhibe actividad de hialuronidasa. Tal fracción se diluye 8-12 veces, preferiblemente 1 veces, con una disolución tampón que permite que la hialuronidasa se una a la resina de intercambio catlónlco fuerte usada para la etapa c). La resina comprende grupos sulfónicos, preferiblemente grupos sulfonil alquilo, aún más preferiblemente grupos sulfonil propilo; según una realización especialmente preferida de la invención, se usa la resina "HiTrap® SP FF". En la práctica, después del equilibrado de la resina con la misma disolución tampón en la que se diluyó la fracción de hialuronidasa obtenida en la etapa b) y de la carga de la muestra, se lleva a cabo el lavado con la misma disolución tampón (alrededor de 2 volúmenes de lecho), tras lo cual se lleva a cabo la elución de las proteínas unidas, incrementando progresivamente el pH del eluyente. En general, para la resina HiTrap® SP FF, la dilución, el equilibrado de la columna y el lavado se llevan a cabo con una disolución tampón de fosfato sódico 2 mM a pH 4, mientras la elución se lleva a cabo con tampón de fosfato sódico 5 mM a pH 4,8; las fracciones con actividad elevada de hialuronidasa se mezclan en una única fracción, que se somete a cromatografía de Intercambio amónico fuerte [etapa d)]. Normalmente, antes de la cromatografía, tal fracción se diluye 8-12 veces, preferiblemente 1 veces, en un tampón de equilibrado adecuado, que permite que la hialuronidasa se una a la resina elegida. La resina para la etapa d) es una resina de intercambio aniónico fuerte que comprende grupos amonio cuaternarios;... [Seguir leyendo]

1. La hialuronidasa de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 que comprende la secuencia de aminoácidos N- terminal mostrada en SEQ ID N° 1 y que tiene un peso molecular de 21,6 kDa, un punto isoeléctrico (pl) que oscila de 4,4 a 4,8 y una actividad enzimática igual o mayor que 4. U.l./mg.

2. Un proceso para la preparación de la hialuronidasa según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

a) someter al sobrenadante obtenido de la fermentación de Streptomyces koganeiensis ATCC 31394 a cromatografía de intercambio catiónico débil y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa;

b) someter a la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa de la etapa a) a diafiltración y cromatografía de intercambio aniónico fuerte y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa;

c) someter a la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa de la etapa b) a cromatografía de intercambio catiónico fuerte y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa;

d) someter a la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa de la etapa c) a cromatografía de intercambio aniónico fuerte y aislar la fracción de proteína con actividad de hialuronidasa.

3. La hialuronidasa según la reivindicación 1 para el uso como medicamento.

4. La hialuronidasa según la reivindicación 3 para el uso en el tratamiento de enfermedades en las que la degradación de ácido hialurónico en los tejidos u órganos afectados es ventajosa o deseable.

5. La hialuronidasa para el uso según la reivindicación 4, en la que la enfermedad se selecciona de edema, inflamación, sabañón, tumores sólidos, alergias mediadas por IgE, enfermedades orales y hemorragias vitreas espontáneas.

6. La hialuronidasa para el uso según la reivindicación 4, en la que la enfermedad es la mastitis bovina.

7. Las composiciones farmacéuticas o veterinarias que contienen la hialuronidasa de la reivindicación 1 mezclada con excipientes y/o vehículos adecuados.

8. Las composiciones según la reivindicación 7 en forma de preparaciones inyectables o de preparaciones tópicas para aplicación epidérmica, transdérmica u oftálmica.

9. Las composiciones según la reivindicación 7 ó 8 que contienen además uno o más principios activos seleccionados de: antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes antitumorales, alérgenos, anestésicos locales, antibióticos, anticuerpos monoclonales, citocinas, enzimas y ácido hialurónico sulfatado.

1. Las composiciones según la reivindicación 9, en las que el principio activo es ácido hialurónico sulfatado y la composición tópica para aplicación epidérmica está en forma de crema, gel, pomada o aerosol.

11. El uso de la hialuronidasa según la reivindicación 1 como reactivo en ensayos bioquímicos para la determinación cuali/cuantitativa de ácido hialurónico.