Generación y uso de patrones isotópicos en comparación fenotípica de espectros de masas de organismos.

Un procedimiento para ensayar similitud o desemejanza fenotípica de un organismo ensayado en comparación con la de un organismo patrón de la misma especie que comprenden las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de material compuesto que comprende una mezcla de cantidades sustancialmente iguales de la primera y segunda muestras,

siendo dicha primera muestra una muestra patrón que comprende concentraciones promedio de una mayoría de compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma (Da) que están presentes en una muestra representativa de la especie de organismo cuyo fenotipo va a ensayarse, estando dichos compuestos constituyentes (i) disueltos o dispersos en un primer medio líquido y (ii) estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas primeras cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de un primer átomo,

siendo dicha segunda muestra una muestra de ensayo que comprende compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa del organismo cuyo fenotipo va a ensayarse, estando dichos compuestos constituyentes (i) disueltos o dispersos en un segundo medio líquido y (ii) estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas segundas cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de dicho primer átomo,

siendo dicha primera y segunda cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos diferentes entre sí, y siendo dicho primer y segundo isótopos distintos de H o D;

(b) analizar por espectroscopía de masas dicha muestra de material compuesto para analitos;

(c) determinar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada analito analizado;

(d) determinar la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto; y

(e) comparar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada analito analizado con la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto, siendo un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas analizadas se desvían estadísticamente significativamente de las relaciones isotópicas analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto fenotípicamente distinto del organismo patrón, y siendo un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas analizadas no se desvían estadísticamente significativamente de las relaciones isotópicas iónicas analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto fenotípicamente similar al organismo patrón.

Generación y uso de patrones isotópicos en comparación fenotípica de espectros de masas de organismos

CAMPO TÉCNICO

La presente solicitud se refiere a la creación y uso de patrones isotópicos en análisis de espectros de masas para identificar similitud o desemejanza fenotípica de un organismo ensayado. Más específicamente, los patrones isotópicos se usan en un sistema que contiene un organismo biológico que es fenotípicamente ensayado para llevar a cabo una comparación fenotípica de organismos biológicos complejos. Un procedimiento contemplado utiliza patrones isotópicos predefinidos y únicos presentes en compuestos conocidos por estar en un primer fenotipo como patrones para la comparación con compuestos presentes en un segundo fenotipo ensayado.

TÉCNICA ANTERIOR

El uso de isótopos estables para la determinación de información biológica tiene una larga e ilustre historia [véase Hellerstein, Metabolic Engineering 6:85-100 (2004) ]. El uso más antiguo y más frecuente es en estudios que investigan el metabolismo en el que un isótopo estable se incorpora en una molécula específica en una localización específica. Esta molécula isotópicamente marcada, o “precursor”, se alimenta a un organismo in vivo, sistema de células in vitro o sistema sin células in vitro durante tanto un periodo de tiempo breve como prolongado, después de lo cual el destino del isótopo se determina, tanto usando RMN, espectrometría de masas (EM) , degradación química, como otra técnica de detección.

A diferencia del uso de isótopos radiactivos, el uso de isótopos estables se considera generalmente seguro y libre de regulación. Aunque en general un estudio normalmente usa un único isótopo incorporado en una localización específica con el fin de lograr una precisión en el entendimiento del destino metabólico de una molécula, otra realización del uso de isótopos estables utiliza moléculas completamente marcadas (>99 % de un átomo se sustituye por un equivalente isotópico) , o universalmente marcada (el isótopo está universalmente distribuido dentro de la molécula diana a menos de los niveles de saturación) . Hay muchos estudios conocidos en los que más de un isótopo se incorpora en una molécula diana, y todos los fragmentos isotópicos se examinan para sus destinos diferenciales. En todos los casos, estos procedimientos son análisis elegidos como diana; es decir, buscan la incorporación de un átomo marcado específico en otras moléculas específicas.

Todavía otro uso de compuestos isotópicamente marcados estables es como patrones internos para sus homólogos no marcados. En un experimento tal, una molécula isotópicamente enriquecida se añade a una muestra o extracto a una concentración conocida antes de un análisis, y la medición final determina la concentración exacta del material no marcado por la comparación. En este tipo de estudio es común para un investigador añadir más de un patrón isotópicamente distinto si va a cuantificarse más de una molécula. De hecho, hay formas extremas en las que se prepara una mezcla extremadamente compleja cultivando un organismo complejo sobre una materia prima isotópicamente definida de forma que el organismo entero esté fuertemente compuesto, si no enteramente, de moléculas que consisten en solo un isótopo [Wu y col., Anal Biochem 336:164-171 (2005) ]. En esta situación, el mismo patrón se introduce en todas las muestras, pero no hay información llevada por el patrón distinta de para los fines de cuantificación relativa; es decir, el patrón no tiene relación con el experimento en cuestión. Históricamente, tales patrones se construyen cuidadosamente para diferenciarse de cualquier otro analito por una diferencia de masa específica.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención contempla un procedimiento para ensayar similitud o desemejanza fenotípica (comparación fenotípica) de un segundo organismo ensayado en comparación con un primer organismo patrón o de control que es frecuentemente de la misma especie. Un procedimiento contemplado comprende las etapas de proporcionar una muestra de material compuesto que comprende una mezcla de cantidades sustancialmente iguales de la primera y segunda muestras. La primera muestra es una muestra patrón (control) que comprende concentraciones promedio de una mayoría de compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 Da (uma) que están presentes en una muestra representativa del primer organismo (control) . Aquellos compuestos constituyentes (i) se disuelven o dispersan en un medio líquido, preferentemente un medio acuoso, y (ii) cada compuesto constituyente comprende las mismas primeras cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de un primer átomo.

La segunda muestra representativa es una muestra de ensayo que comprende compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa del segundo organismo de prueba cuyo fenotipo va a ensayarse. Los compuestos constituyentes (i) se disuelven o dispersan en un medio líquido, preferentemente un medio acuoso, y (ii) cada compuesto constituyente comprende las mismas segundas cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables del primer átomo. La primera y la segunda cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos son diferentes entre sí, y el primer y segundo isótopos son distintos de H o D.

La muestra de material compuesto preparada para análisis se analiza por espectroscopía de masas para picos de analito. La relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo se determina para cada pico de analito analizado. Se determina la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto. La relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada pico de analito analizado se compara con la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto. Un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas de pico analizadas se desvían estadísticamente significativamente de las relaciones isotópicas de pico analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto son fenotípicamente distintas del organismo patrón. Un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas de pico analizadas no se desvían estadísticamente significativamente de las relaciones isotópicas de pico analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto es fenotípicamente similar al organismo patrón.

En otra realización, una biblioteca de relaciones de pico isotópicas fenotípicas o perfiles de diversos organismos se prepara y se usa para comparación con organismos cuya identidad es desconocida o se desea conocer. La invención también se refiere a un procedimiento para crear una biblioteca de perfiles de miembros de relaciones isotópicas fenotípicas de diferentes organismos, siendo cada perfil de miembro una pluralidad de relaciones obtenidas de espectros de masas del primer isótopo con respecto al segundo isótopo que están presentes en cada pico de analito analizado con respecto a la mediana de la relación isotópica de una muestra de material compuesto de cada organismo diferente, estando dicha muestra de material compuesto comprendida de una mezcla de cantidades sustancialmente iguales de la primera y segunda muestras, siendo dicha primera muestra una muestra patrón que comprende concentraciones promedio de una mayoría de compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa de un primer organismo, estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas primeras cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de un primer átomo, y siendo dicha segunda muestra una muestra de ensayo que comprende compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa del organismo cuyo fenotipo se ensaya, estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas segundas cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de dicho primer átomo, siendo dicha primera y segunda cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos diferentes entre sí, y siendo dicho primer y segundo isótopos distintos de H o D, en la que el procedimiento comprende:

(a) analizar por espectroscopía de masas dicha muestra de material compuesto de cada organismo diferente para picos de analito;

(b) determinar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada pico de analito analizado;

(c) determinar la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto; y

(d) guardar la pluralidad de relaciones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para ensayar similitud o desemejanza fenotípica de un organismo ensayado en comparación con la de un organismo patrón de la misma especie que comprenden las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de material compuesto que comprende una mezcla de cantidades sustancialmente iguales de la primera y segunda muestras, siendo dicha primera muestra una muestra patrón que comprende concentraciones promedio de una mayoría de compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma (Da) que están presentes en una muestra representativa de la especie de organismo cuyo fenotipo va a ensayarse, estando dichos compuestos constituyentes (i) disueltos o dispersos en un primer medio líquido y (ii) estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas primeras cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de un primer átomo, siendo dicha segunda muestra una muestra de ensayo que comprende compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa del organismo cuyo fenotipo va a ensayarse, estando dichos compuestos constituyentes (i) disueltos o dispersos en un segundo medio líquido y (ii) estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas segundas cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de dicho primer átomo, siendo dicha primera y segunda cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos diferentes entre sí, y siendo dicho primer y segundo isótopos distintos de H o D;

(b) analizar por espectroscopía de masas dicha muestra de material compuesto para analitos;

(c) determinar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada analito analizado;

(d) determinar la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto; y

(e) comparar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada analito analizado con la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto, siendo un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas analizadas se desvían estadísticamente significativamente de las relaciones isotópicas analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto fenotípicamente distinto del organismo patrón, y siendo un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas analizadas no se desvían estadísticamente significativamente de las relaciones isotópicas iónicas analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto fenotípicamente similar al organismo patrón.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos compuestos constituyentes de la muestra de ensayo contienen dicho primer y segundo isótopos estables de dicho primer átomo en sus cantidades naturalmente abundantes.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo se analiza para menos de todos los analitos observados.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer y segundo medios líquidos son los mismos.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer y segundo medios líquidos son acuosos.

6. Un procedimiento para identificar similitud o desemejanza fenotípica de un organismo ensayado con respecto al de un organismo patrón de la misma especie que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un primer muestra patrón que comprende concentraciones promedio de una mayoría de compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa de la especie de organismo cuyo fenotipo va a ensayarse, estando dichos compuestos constituyentes (i) disueltos o dispersos en un medio acuoso y (ii) estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas primeras cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de un primer átomo;

(b) proporcionar una segunda muestra de ensayo que comprende compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en el organismo cuyo fenotipo va a ensayarse, estando dichos compuestos constituyentes (i) disueltos o dispersos en un medio acuoso y (ii) estando comprendido cada compuesto constituyente del primer y segundo isótopos estables de dicho primer átomo presente en su relación naturalmente abundante, siendo dicha primera y segunda cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos diferentes entre sí, y siendo dicho primer y segundo isótopos distintos de H o D;

(c) mezclar cantidades sustancialmente iguales de la primera y segunda muestras para formar una muestra de material compuesto;

(d) analizar por espectroscopía de masas dicha muestra de material compuesto para analitos;

(e) determinar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada analito analizado;

(f) determinar la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto; y

(g) comparar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada analito analizado con la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto, siendo un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas de pico analizadas se desvían estadísticamente significativamente de las

relaciones isotópicas de pico analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto fenotípicamente distinto del organismo patrón, y siendo un organismo ensayado cuyas relaciones isotópicas analizadas no se desvían estadísticamente significativamente de las relaciones isotópicas analizadas de la mediana de la muestra de material compuesto fenotípicamente similar al organismo patrón.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha muestra de ensayo se obtuvo de un cultivo celular o una planta o un animal.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha muestra de ensayo se obtiene de un cultivo celular que comprende células vegetales, preferentemente células vegetales superiores o células de alga.

9. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha muestra de ensayo se obtiene de un cultivo celular que comprende células bacterianas.

10. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la muestra de ensayo se obtiene de un cultivo celular que comprende células animales.

11. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dichas primeras cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de un primer átomo presentes en los compuestos constituyentes de la primera muestra patrón están presentes en una relación invertida de cantidad con respecto a la relación de abundancia natural de dicho primer y segundo isótopos estables de un primer átomo de los compuestos constituyentes de la segunda muestra de ensayo.

12. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha primera muestra patrón es una muestra sintética que se prepara basándose en el conocimiento predeterminado de la mayoría de compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa del primer organismo y las cantidades de aquellos constituyentes.

13. Un procedimiento para crear una biblioteca de perfiles de miembros de relaciones isotópicas fenotípicas de diferentes organismos, siendo cada perfil de miembro una pluralidad de relaciones obtenidas de espectros de masas del primer isótopo con respecto al segundo isótopo que están presentes en cada pico de analito analizado con respecto a la mediana de la relación isotópica de una muestra de material compuesto de cada organismo diferente, estando dicha muestra de material compuesto comprendida de una mezcla de cantidades sustancialmente iguales de la primera y segunda muestras, siendo dicha primera muestra una muestra patrón que comprende concentraciones promedio de una mayoría de compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa de un primer organismo, estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas primeras cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de un primer átomo, y siendo dicha segunda muestra una muestra de ensayo que comprende compuestos constituyentes que tienen una masa molecular inferior a 1000 uma que están presentes en una muestra representativa del organismo cuyo fenotipo se ensaya, estando comprendido cada compuesto constituyente de las mismas segundas cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos estables de dicho primer átomo, siendo dicha primera y segunda cantidades predeterminadas del primer y segundo isótopos diferentes entre sí, y siendo dicho primer y segundo isótopos distintos de H o D, en el que el procedimiento comprende:

(a) analizar por espectroscopía de masas dicha muestra de material compuesto de cada organismo diferente para picos de analito;

(b) determinar la relación del primer isótopo con respecto al segundo isótopo para cada pico de analito analizado;

(c) determinar la relación isotópica de la mediana de la muestra de material compuesto; y

(d) guardar la pluralidad de relaciones obtenidas de espectros de masas del primer isótopo con respecto al segundo isótopo que están presentes en cada pico de analito analizado con respecto a la mediana de la relación isotópica de la muestra de material compuesto en un perfil de miembro.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que perfiles de miembros individuales de la biblioteca son relaciones fenotípicas de cepas, variedades, especies de un organismo.

15. El procedimiento según la reivindicación 6 o el procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho primer y segundo isótopos están seleccionados del grupo que consiste en 12C y 13C; 16O, 17O y 18O; 14N y 15N; 32S, 33S, 34S y36S; 35Cl y 37Cl; 24Mg, 25Mg y 26Mg; 27Si, 28Si y 29Si; 41Ca, 42Ca, 43Ca, y 44Ca; y 79Br y 81Br.