Análisis multiplex de proteína transgénica apilada.

Un método de alto rendimiento para detectar la presencia de dos o más proteínas de interés con secuencias de aminoácidos conocidas en una muestra de origen vegetal a partir de una planta transgénica,

comprendiendo el método:

i) proveer datos espectrales de masas para dos o más proteínas que son productos esperados de la expresión transgénica en la planta transgénica;

ii) proveer una primera inyección de una muestra basada en plantas complejas que comprende proteínas, en donde la muestra es una matriz vegetal cruda extraída de un tejido de interés;

iii) poner en contacto la matriz vegetal cruda con una proteasa para digerir las proteínas a péptidos;

iv) inyectar la matriz vegetal cruda digerida en un dispositivo de LC-MS;

v) obtener datos espectrales de masas simultáneos para los péptidos;

vi) comparar los datos espectrales de masas simultáneos de v) con los datos espectrales de masas provistos por las dos o más proteínas de interés, determinando de esta manera la presencia o ausencia de las dos o más proteínas de interés.

Análisis multiplex de proteína transgénica apilada

Campo técnico

La invención se relaciona en general con análisis de alto rendimiento de características de plantas. En particular, la invención se relaciona con un método de análisis de alto rendimiento y cuantificación de proteínas de plantas determinadas por espectrometría de masas con una inyección sencilla de muestras de proteínas complejas derivadas a partir de plantas y tejidos vegetales.

Antecedentes El uso creciente de la tecnología de ADN recombinante para producir plantas transgénicas de uso comercial e industrial requiere el desarrollo de métodos de alto rendimiento de análisis de líneas vegetales transgénicas. Tales métodos son necesarios para mantener las variedades de plantas transgénicas a través de generaciones sucesivas, con el fin de evitar el escape de transgenes hacia el ambiente, y para ayudar en el desarrollo rápido de plantas transgénicas con fenotipos deseables u óptimos. Además, las guías actuales para la definición de la seguridad de plantas GM propuestas para consumo humano requieren la caracterización a nivel de ADN y proteína entre el cultivo original y el transformado. Sesikeran and Vasanthi (2008) Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17 Suppl. 1:241-44. Nuevas variedades de plantas que son desarrolladas consisten de modificaciones genéticas crecientemente complejas incluyendo, inter alia, genes y características apilados.

Los métodos actuales para análisis de plantas transgénicas que son preferidos en la técnica son: técnicas basadas en ADN (por ejemplo, PCR) ; RT-PCR; el uso de genes informadores; inmunoprecipitación Southern; e inmunoquímica. Todas estas metodologías sufren de diversas limitaciones, y se desea un método superior que sea ampliamente capaz de identificar rápidamente y sin costos elevados y cuantificar productos genéticos transgénicos múltiples de una forma con alto rendimiento a partir de una muestra limitada de una planta transgénica.

Las técnicas basadas en ADN para el análisis de plantas transgénicas sufre de varias suficiencias notables. A pesar del hecho de que la transformación mediada por Agrobacterium es el método más preferido de transformación genética de plantas, los genotipos de plantas transformadas por Agrobacterium son difíciles de analizar por metodologías basadas en PCR. Véase Nain et al. (2005) Plant Mol. Biol. Rep. 23:59-65. La presencia incluso de cantidades traza de Agrobacterium en tejidos transformados produce resultados de PCR desviados. Id. Los formatos de amplificación de ADN también requieren la prueba empírica de cebadores específicos para el gen y condiciones de termociclización. De la manera más significativa, las metodologías basadas en ADN para la selección de plantas transgénicas no determinan realmente la expresión de la proteína producto genético. De la misma manera, el análisis por RT-PCR o inmunoprecipitación Northern puede ser utilizado para confirmar la presencia de transcriptos transgénicos en material vegetal transgénico. Alwine et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5350-54; Toplak et al. (2004) Plant Mol. Biol. Rep. 22:237-50. Ninguno de estos métodos confirma la presencia de la expresión real de proteína en el material vegetal fuente. Estas técnicas también requieren el uso de materiales radioactivos y/o grandes cantidades de tejido y tiempo de procesamiento.

Los genes informadores, tales como los genes que modifican las proteínas fluorescentes, también pueden ser cotransformados en plantas transgénicas para proveer una herramienta para identificar transformantes. Sin embargo, los genes informadores son solamente informadores indirectos de la recombinación genética. La expresión del constructo del gen informador no confirma la expresión del transgén acompañante. Adicionalmente, bien sea el gen transportador o el transgén pueden perderse en generaciones sucesivas de la planta hospedera, desacoplando por lo tanto la presencia del informador del transgén de interés. De la misma manera, los transgenes pueden escaparse de la planta hospedera hacia plantas vecinas, por ejemplo por polinización cruzada, sin el escape concurrente del gen informador. Cuando se apilan múltiples genes en una planta transgénica, un número igual de genes informadores tendría que ser introducido para analizar el proteoma transgénico, y por lo tanto la función del gen informador es solamente un informador indirecto de la función transgénica, y no se detectarían cambios en la expresión de un transgén en respuesta a la presencia de un transgén adicional.

A diferencia de los métodos delineados anteriormente, la inmunoquímica puede ser utilizada para identificar productos de expresión transgénica en una planta transgénica. Aunque la inmunoquímica es útil para este propósito, el método requiere muestras de proteína altamente purificadas para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos resultantes deben ser probados en cuanto a su especificidad, y deben desarrollarse condiciones de ensayo específicas del reactivo. Los altos niveles de expresión y purificación requeridos para llevar a cabo la inmunoquímica, así como el problema

relacionado de eliminar los contaminantes del tejido vegetal, son limitaciones para la utilidad de este método.

La espectrometría de masas también puede ser utilizada para analizar el proteoma de una planta transgénica. Sin embargo, las técnicas espectrométricas reconocidas por el arte requieren mezclas complejas de proteínas vegetales para ser separadas primero por electroforesis en gel 2-D. Rajagopal and Ahern (2001) Science 294 (5551) :2571-73; Véase también Domon and Aebersold (2006) Science 312 (5771) :212-17, 214. Las bandas individuales de la muestra de proteínas separadas en gel pueden ser digeridas con una proteasa y sometidas a espectrometría de masas para identificar la proteína única presente originalmente en la banda no digerida. Véase, por ejemplo, Chang et al. (2000) Plant Physiol. 122 (2) :295-317. La etapa de separación en gel en este método es un proceso que consume tiempo que impide el uso de espectrometría de masas en aplicaciones de alto rendimiento. La WO2007/132164 describe un método para detectar la presencia de una proteína transgénica, EPSPS, en un material derivado de plantas que comprende proveer un extracto vegetal, enriquecer el extracto y digerirlo usando una proteasa antes de llevar a cabo la espectrometría de masas. Los ensayos descritos requieren todos el enriquecimiento de la proteína, por ejemplo, a través de fraccionamiento, antes de llevar a cabo la MS.

Bhushan et al (Plant and Cell Physiology Vol 46, No. 6, 1 Januar y 2005 p985-996) describe la identificación y caracterización de una proteasa de degradación de péptidos novedosa, AtPreP2.

Hay una necesidad en el arte por un método de alto rendimiento para detectar y cuantificar la presencia de productos de la expresión transgénica en plantas que no requiera proteína purificada o altamente expresada, o reactivos específicos para el método. Este método será útil en ayudar a los cultivadores y agricultores de plantas transgénicas a mantener el fenotipo de la variedad de planta transgénica objetivo a través de generaciones sucesivas de reproducción sexual y/o asexual. El método también será útil en analizar rápidamente las plantas producidas de un procedimiento de transformación para identificar aquellas plantas producidas que son plantas transgénicas y expresan la proteína introducida en los tejidos deseados. Adicionalmente, el método puede ser utilizado para seleccionar rápidamente plantas en riesgo de ser contaminadas con transgenes de una planta transgénica, con el fin de alcanzar el bioconfinamiento de la planta transgénica.

Divulgación de la invención La presente invención provee un método de alto rendimiento para detectar la presencia de dos o más proteínas de interés con secuencias de aminoácidos conocidas en una muestra basada en plantas a partir de una planta transgénica, comprendiendo el método:

i) proveer datos espectrales de masas para dos o más proteínas que son productos esperados de la expresión transgénica en la planta transgénica;

ii) proveer una primera inyección de una muestra compleja basada en plantas que comprende proteínas, en donde la muestra es una matriz vegetal cruda extraída de un tejido de interés;

iii) poner en contacto la matriz vegetal cruda con una proteasa para digerir las proteínas a péptidos;

iv) inyectar la matriz vegetal cruda digerida en un dispositivo de LC-MS;

v) obtener datos espectrales de masa simultáneos para los péptidos;

vi) comparar los datos espectrales de masa simultáneos de v) con los datos espectrales de masas provistos por las... [Seguir leyendo]

1. Un método de alto rendimiento para detectar la presencia de dos o más proteínas de interés con secuencias de aminoácidos conocidas en una muestra de origen vegetal a partir de una planta transgénica, comprendiendo el método: i) proveer datos espectrales de masas para dos o más proteínas que son productos esperados de la expresión transgénica en la planta transgénica; ii) proveer una primera inyección de una muestra basada en plantas complejas que comprende proteínas, en donde la muestra es una matriz vegetal cruda extraída de un tejido de interés;

iii) poner en contacto la matriz vegetal cruda con una proteasa para digerir las proteínas a péptidos; iv) inyectar la matriz vegetal cruda digerida en un dispositivo de LC-MS; 10 v) obtener datos espectrales de masas simultáneos para los péptidos; vi) comparar los datos espectrales de masas simultáneos de v) con los datos espectrales de masas provistos por las dos o más proteínas de interés, determinando de esta manera la presencia o ausencia de las dos o más proteínas de interés.

2. El método de la reivindicación 1 en donde las dos o más proteínas de interés son dos proteínas de interés o cuatro 15 proteínas de interés.