Gen para la fucosiltransferasa.

Procedimiento para la preparación de glicoproteínas recombinantes,

que comprende la producción de unaglicoproteína recombinante en plantas o células de plantas, cuya producción de GlcNAc-a-1,3-fucosiltransferasa esinhibida o completamente impedida y cuya actividad de GlcNAc-a-1,3-fucosiltransferasa endógena es inferior al 50%de la actividad de GlcNAc-a-1,3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales, ycuya GlcNAc-a-1,3-fucosiltransfera es codificada por una molécula de ADN, que comprende una secuencia según laSEC ID no 1 con un marco de lectura abierto del par de bases 211 al par de bases 1740 o presenta una homologíade por lo menos un 50% con respecto a la secuencia citada anteriormente o hibridiza con la secuencia citadaanteriormente en condiciones rigurosas o comprende una secuencia que, como consecuencia del código genético,está degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente.

Gen para la fucosiltransferasa.

La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican para una fucosiltransferasa. La invención se refiere también a partes de la secuencia de dichos polinucleótidos así como a vectores que contienen dichos polinucleótidos, a células hospedadoras recombinantes y a plantas que han sido transfectadas por los polinucleótidos o por el ADN procedente de los mismos, así como a las glicoproteínas producidas en dicho sistema.

Las glicoproteínas presentan una multitud y complejidad de unidades de carbohidratos, cuya composición y disposición son características para organismos diferentes. Las unidades de oligosacárido de las glicoproteínas desempeñan una serie de funciones; así, por ejemplo, son importantes en la regulación del metabolismo, participan en la mediación de interacciones intercelulares, establecen los tiempos de circulación de proteínas en la circulación sanguínea y son decisivos para la detección de epítopes en las reacciones antigen/anticuerpo.

La glicosilación de las glicoproteínas comienza en el retículo endoplásmico (RE) , donde se unen los oligosacáridos o bien a las cadenas laterales de asparagina por enlaces N-glucosílicos o bien a las cadenas laterales de serina o treonina por enlaces O-glucosílicos. Los oligosacáridos con enlaces N-glucosílicos contienen un núcleo común de una unidad de pentasacárido constituida por tres radicales de manosa y dos radicales de N-acetilglucosamina. Para la modificación ulterior de las unidades de carbohidratos, las proteínas son transportadas por el RE al complejo de Golgi. La estructura de las unidades de oligosacárido con enlace N-glucosílico de las glicoproteínas es determinada por su conformación y la composición de las glicosiltransferasas de los compartimentos Golgi en los que son procesadas.

Se ha demostrado que en el complejo de Golgi de algunas células de plantas e insectos la unidad de pentasacárido del núcleo se encuentra substituida por xilosa y fucosa con enlace α-1, 3 (P. Lerouge et al. 1998 Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al. 1998 L. Exp. Bot. 49, 1463-1472) . El heptasacárido “MMXF3” resultante constituye el tipo del oligosacárido principal en las plantas (Kurosaka et al. 1991 J. Biol. Chem., 266, 4168-4172) . Así, por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante, la β–fructosidasa de zanahorias y la lectina de Er y thrina cristagalli así como la fosfolipasa A2 del veneno de las abejas melíferas o las glicoproeínas de la membrana neuronal de los embriones de insectos contienen radicales de α-1, 3-fucosa, unidos al núcleo de glicano. Estas estructuras se denominan también N-glicanos complejos o N-glicanos deficientes en manosa o N-glicanos truncados. Además, los radicales α-manosilo pueden ser substituidos por GlcNAc, a los cuales están unidos galactosa y fucosa, produciendo una estructura que corresponde al epítope humano Lewis a (Melo et al. 1997, FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine et al. 1997 Plant

J. 12, 1411-1417) .

Ni la xilosa ni la fucosa con enlace α-1, 3 se encuentran en las glicoproteínas de mamíferos. Resulta que la α-1, 3fucosa del núcleo desempeña un papel importante en la detección de epítopes de anticuerpos dirigidos contra los oligosacáridos con enlace N de insectos (I.B.H. Wilson et al., Glycobiology Vol. 8, no 7, p. 651-661, 1998) , disparando reacciones inmunes en el cuerpo humano o animal contra dichos oligosacáridos. Además, el radical α1, 3-fucosa parece ser una de las causas principales para la reactividad cruzada alérgica muy difundida entre los varios alergenos de plantas y de insectos (Tretter et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 1993; 102:259-266) y se denomina también “determinante de carbohidrato de reacción cruzada” (CCD) . En un estudio de los epítopes de tomates y polen de hierba se determinaron también radicales fucosa con enlace α-1, 3 como determinante común, lo cual parece ser la causa de la frecuente aparición común de alergias de tomates y de polen de hierba en pacientes (Petersen et al. 1996, J. Allergy Clin. Immunol, Vol 98, 4; 805-814) . Además, por la frecuente apariencia de las reacciones cruzadas inmunológicas, los CCDs ocultan los diagnósticos de alergias.

Dichas reacciones inmunológicas, que son desencadenadas por las proteínas de plantas en el cuerpo humano, representan el problema principal de la utilización médica de las proteínas humanas recombinantes, producidas en plantas. Para evitar dicho problema, habría que impedir la α-1, 3-fucosilación del núcleo. En un estudio, se ha podido demostrar que los oligosacáridos que incluyen una L-galactosa en lugar de una L-fucosa (6-deoxi-L-galactosa) son no obstante completamente activos biológicamente (E. Zablackis et al. 1996, Science, Vol 272) . Según otro estudio, se aisló una mutante de la planta Arabidopsis thaliana, a la que falta la N-acetilglucosaminiltransferasa I, que constituye la primera enzima en la biosintésis de glicanos complejos. La biosíntesis de las glicoproteínas complejas en dicha mutante se encuentra por lo tanto perturbada. No obstante, dichas plantas mutadas son capaces de desarrollarse de forma normal en ciertas condiciones (A. Schaewen et al. 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118) .

Para impedir selectivamente el enlace de la α-1, 3-fucosa del núcleo en un oligosacárido, sin por ello intervenir también en otras etapas de la glicosilación, habría que eliminar sólo la enzima que es directamente responsable de dicha glicosilación específica, es decir, la α-1, 3-fucosiltransferasa del núcleo. Por primera vez, dicha transferasa se aisló y se caracterizó a partir de judías Mungo, y se descubrió que la actividad de dicha enzima es dependiente de la presencia de términos GlcNAc no reductores (Staudacher et al., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786) . Dicha transferasa, que tiene lugar sólo en plantas e insectos, pero no en el ser humano u otros vertebrados habría que ser desactivada o inhibida selectivamente, con el fin de conseguir que las proteínas humanas que son producidas en plantas o células de plantas o también en insectos o células de insectos ya no contienen, a diferenica de antes, dicho epítope que dispara las reacciones inmunes.

El artículo de John M. Burke “Clearing the way for ribozymes” (Nature Biotechnology 15:414-415; 1997) se refiere al modo de funcionamiento general de ribozimas.

El artículo de Pooga et al. “Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo” (Nature Biotechnology 16:857-861; 1998) se refiere a las moléculas de ANP de forma generalizada y específicamente a una molécula de ANP que es complementaria al ARNm humano del tipo de receptor de galanina 1.

La patente US no 5.272.066 A se refiere a un procedimiento para la modificación de proteínas eucariotes y procariotes, con el fin de prolongar su circulación in vivo. En dicho procedimiento, se modifican los oligosacáridos ligados con la ayuda de diferentes enzimas, entre las cuales se encuentra también la GlcNac-α1->3 (4) fucosiltransferasa.

El documento EP 0 643 132 A1 se refiere a la clonación de una α-1, 3-fucosiltransferasa aislada a partir de células humanas (THP-1) . Las cadenas de carbohidratos descritas en dicho documento corresponden a los oligosacáridos humanos del tipo sialil Lewis x y sialil Lewis a. La especificidad de la enzima procedente de células humanas es completamente distinta a la de la fucosiltransferasa procedente de células de plantas.

Otras fucosiltransferasas animales se describen en Costache et al. (J. Biol. Chem. 272 (47) , (1997) : 29721-29728) .

Un objetivo de la presente invención es clonar y secuenciar el gen que codifica para una fucosiltransferasa vegetal, así como proporcionar un procedimiento para preparar glicoproteínas, que comprenden la α-1, 3-fucosa del núcleo que normalmente tiene lugar.

El objetivo según la invención se alcanza por medio de un procedimiento para preparar glicoproteínas recombinantes, que comprende la producción de una glicoproteína recombinante en plantas o células de plantas, cuya producción de GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa queda inhibida o completamente impedida y cuya actividad de GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa está por debajo de un 50% de la actividad de GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa que tiene lugar en plantas o células de plantas naturales y la GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa es codificada por una molécula de ADN, que utiliza una secuencia según la SEC ID No:1 (en la presente memoria se utilizó el código IUPAC, en el que “N” representa inosina) con un marco de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de glicoproteínas recombinantes, que comprende la producción de una glicoproteína recombinante en plantas o células de plantas, cuya producción de GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa es 5 inhibida o completamente impedida y cuya actividad de GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa endógena es inferior al 50% de la actividad de GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales, y cuya GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransfera es codificada por una molécula de ADN, que comprende una secuencia según la SEC ID no 1 con un marco de lectura abierto del par de bases 211 al par de bases 1740 o presenta una homología de por lo menos un 50% con respecto a la secuencia citada anteriormente o hibridiza con la secuencia citada anteriormente en condiciones rigurosas o comprende una secuencia que, como consecuencia del código genético, está degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las glicoproteínas recombinantes son proteínas humanas, en particular proteínas para uso médico. 15

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la actividad de GlcNAc-α-1, 3fucosiltransferasa endógena es inferior al 20% de la actividad de la GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la actividad de la GlcNAc-α-1, 3fucosiltransferasa endógena es el 0% de la actividad de la GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la reducción de la actividad de la GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa resulta de la inhibición antisentido, siendo utilizado un polinucleótido, que es por lo menos parcialmente complementario de la secuencia de la molécula de ADN.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la reducción de la actividad de la GlcNAc-α-1, 3-fucosiltransferasa resulta de la mutación “knockout” de la secuencia de la molécula de ADN. 30