Fragmentos Truncados de alfa sinucleína en la demencia de cuerpos de Lewy.

Un fragmento de alfa - sinucleína, que es alfa sinucleína SN1 - 135, con residuos numerados según la SEC ID Nº 1.

ANTECEDENTES

Las demencias con cuerpos de Lewy (DCLs) se caracterizan por la degeneración del sistema dopaminérgico, alteraciones motoras, deficiencia cognitiva y formación de cuerpos de Lewy (CLs) . (McKeith et al., Clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB) : Report of the CDLB International Workshop, Neurology (1996) 47: 1113 – 24) . Las DCLs incluyen la enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy difusos (DCLD) , la variantes con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (VCL) y PD y enfermedad de Alzheimer (EA) combinada y los síndromes identificados como atrofia multisistémica (AMS) . La demencia con cuerpos de Lewy (DCL) es un término acuñado para reconciliar las diferencias en la terminología de las DCLs. Los trastornos con CL continúan siendo una causa común de los trastornos del movimiento y del deterioro cognitivo en la población de edad avanzada (Galasko et al., Clinical neuropathological correlations in Alzheimer’s disease and related dementias. Arch. Neurol. (1994) 51: 888 – 95) . Aunque su incidencia continua incrementado la creación de un grave problema de salud pública, a día de hoy estos trastornos carecen de tratamientos aprobados (Tanner et al., Epidemiology of Parkinson’s disease and akinetic syndromes, Curr. Opin. Neurol. (2000) 13: 427 – 30) . La causa de la DCL es controvertida y se sugiere que múltiples factores desempeñan un papel en esta, incluyen varias neurotoxinas y factores de susceptibilidad genética.

La EA, la EP y la DCLD son los trastornos neurodegenerativos más comúnmente hallados en las personas de edad avanzada. Estudios epidemiológicos recientes han demostrado una relación clínica cercana entre la EA y la EP, ya que el 30 % de los pacientes con Alzheimer también tiene EP. En comparación al resto de la población de edad avanzada, los pacientes con EA tienen más probabilidad de desarrollar EP concomitante. Además, los pacientes con EP que se convierten en dementes han desarrollado, normalmente, la EA clásica. Aunque cada enfermedad neurodegenerativa parece tener predilección por regiones cerebrales y poblaciones celulares específicas, tienen como resultado diferentes características patológicas, EP, EA y DCLD también comparten distintivos patológicos comunes. Los pacientes con EA familiar, síndrome de Down o EA esporádica desarrollan CLs en la amígdala, que son los distintivos neuropatológicos clásicos de la EP. Además, cada enfermedad se asocia a la degeneración de neuronas, conexiones sinápticas interneuronales y, finalmente, muerte celular, la disminución de neurotransmisores, y la acumulación anormal de proteínas mal plegadas, los precursores de lo que participa en las funciones normales del sistema nervioso central. Estudios bioquímicos han confirmado una relación entre EA, EP y DCL.

En los últimos años, ha surgido una nueva esperanza para comprender la patogénesis de la DCL. Específicamente, diversos estudios han mostrado que la proteína sináptica alfa – sinucleína desempeña un papel central en la patogénesis de la EP ya que: (1) esta proteína se acumula en los CLs (Spillantini et al., Nature (1997)

388: 839 - 40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152: 367 - 72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239: 45 - 8) ,

(2) las mutaciones en el gen de la alfa – sinucleína se cosegregan con formas familiares raras de parkinsonismo (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18: 106 - 8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276: 2045 - 7) y, (3) su sobreexpresión en ratones transgénicos (Masliah et al., Science (2000) 287: 1265 - 9) y Drosophila (Feany et al., Nature (2000) 404: 394 – 8) imita varios aspectos patológicos de la EP. Por lo tanto, el hecho de la acumulación de alfa – sinucleína en el cerebro se asocia con alteraciones morfológicas y neurológicas similares en especies tan diversas como humanos, ratones y moscas sugieren que esta molécula contribuye al desarrollo de la EP.

Las placas neuríticas, que son el distintivo patológico clásico de la EA consisten, esencialmente, en péptido beta - amiloide (Aº) , un aminoácido proteolítico producto de la proteína precursora amiloide (APP) , y NAC, un fragmento proteolítico de alfa - sinucleína de 35 aminoácidos. Tanto el Aº como el NAC se identificaron en primer lugar en placas amiloides como fragmentos proteolíticos de sus respectivas proteínas completas, para las que se identificaron y clonaron ADNcs completos. (Iwai A., Biochim. Biophys. Acta (2000) 1502: 95 - 109) ; Masliah et al., AM. J. Pathol (1996) 148: 201 - 10; Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 11282 – 6) .

La alfa – sinucleína es parte de una gran familia de proteínas, incluyendo la sinucleína beta – y gamma – y la sinoretina. La alfa – sinucleína se expresa en el estado normal asociados a sinapsis y se cree que desempeña un papel en la plasticina neuronal, el aprendizaje y la memoria. Se han identificado mutaciones de alfa – sinucleína en humanos (h) que aumentan la agregación de alfa – sinucleína (Ala30Pro y Ala53Thr) y se asocian con formas raras de formas dominantes autosómicas de la EP. Se desconoce el mecanismo mediante el cual estas mutaciones incrementan la propensión de la alfa – sinucleína para agregarse.

La patente WO – A – 2005013889 identifica nuevos fragmentos de alfa – sinucleína en pacientes con Demencia con Cuerpos de Lewy (DCL) y en modelos animales transgénicos de la misma. Los fragmentos tienen un extremo C – terminal truncado respecto a la alfa – sinucleína completa. Algunos fragmentos se caracterizan por tener un peso molecular de unos 12 kDa como se determinó por la electroforesis en gel SDS en tampón de tricina y una truncación de, al menos, diez aminoácidos contiguos a partir del extremo C – terminal de la alfa – sinucleína natural. El sitio de clivaje preferible tiene lugar tras el residuo (117) y antes del residuo (126) de la alfa – sinucleína natural. La patente WO – A – 2005013889 establece que la identificación de estos nuevos fragmentos de alfa – sinucleína tiene numerosas aplicaciones en, por ejemplo, el descubrimiento de fármacos, diagnósticos, terapéuticos y animales transgénicos.

Resumen de la invención [0007] La invención presenta un fragmento de alfa – sinucleína, que es alfa – sinucleína SN1 – 135, con residuos numerados según la SEC ID Nº 1.

La invención presenta métodos de cribado para un agente con actividad farmacológica útil para el tratamiento de la Demencia con Cuerpos de Lewy (DCL) . El método incluye poner en contacto el agente con el fragmento de alfa – sinucleína; y determinar la velocidad o la extensión de la agregación del fragmento de alfa – sinucleína, en la que una reducción de la velocidad o de la extensión de la agregación respecto al control sin el agente indica que el agente tiene la actividad farmacológica.

Opcionalmente, el fragmento de alfa – sinucleína soporta una mutación asociada con una DCL hereditaria, como una mutación A53T. Opcionalmente, el método incluye un paso adicional de realizar un ensayo en un modelo animal no humano de DCL para determinar si el agente trata o inhibe un síntoma de la DCL.

La invención presenta, además, métodos de cribado de un agente para una actividad farmacológica útil en el tratamiento una DCL (por ejemplo la enfermedad de Parkinson o DCLD) , comprendiendo poner en contacto una célula que expresa alfa – sinucleína y procesar la alfa – sinucleína en el fragmento con un agente. Se determina entonces un nivel del fragmento en la célula respecto al nivel de referencia en el mismo tipo de célula en ausencia del agente, una reducción en el nivel del fragmento respecto al nivel de referencia indica que el agente tiene actividad farmacológica útil en el tratamiento de la DCL. Opcionalmente, el fragmento de alfa – sinucleína contiene una mutación asociada a una DCL hereditaria, como una mutación A53T. La célula puede ser una célula humana, una célula neuronal, una célula dopaminérgica o una célula no dopaminérgica. Opcionalmente, la célula es célula PC12 o Sy5Y. Opcionalmente, el método incluye un paso de realizar un ensayo en un modelo animal no humano de DCL para determinar si el agente trata o inhibe un síntoma de la DCL.

La invención presenta, además, métodos de cribado de un agente con actividad farmacológica útil para tratar una DCL (por ejemplo la enfermedad de Parkinson o DCLD) . El método incluye poner en contacto un animal transgénico no humano que expresa el fragmento alfa – sinucleína y determinar un nivel de... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de alfa – sinucleína, que es alfa sinucleína SN1 – 135, con residuos numerados según la SEC ID Nº 1.

2. Un fragmento de la reivindicación 1, en el que el fragmento de alfa – sinucleína contiene una mutación asociada con la demencia con cuerpos de Lewy hereditaria (DCL) , preferiblemente una mutación A53T.

3. Un método para cribar un agente que tiene una actividad farmacológica útil para el tratamiento de la demencia con cuerpos de Lewy (DCL) que comprende:

poner en contacto el agente con un fragmento de alfa – sinucleína, tal y como se define en las reivindicaciones 1 o 2; y determinar la velocidad o extensión de agregación de alfa – sinucleína o fragmento de alfa – sinucleína, en el que una reducción en la velocidad o extensión de agregación respecto a un control que carece de agente, indica que el agente tiene una actividad farmacológica.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el fragmento de alfa – sinucleína está fosforilado.

5. Un método de cribado de un agente que tiene una actividad farmacológica útil para el tratamiento de la (DCL) que comprende:

poner en contacto una célula que expresa alfa – sinucleína y procesar la alfa – sinucleína en un fragmento con un agente, en el que el agente se define en las realizaciones 1 o 2; y determinar un nivel del fragmento en la célula con relación al nivel de referencia en el mismo tipo celular en ausencia del agente, una reducción en el nivel del fragmento con relación a la referencia indica que el agente tiene una actividad farmacológica útil en el tratamiento de la DCL.

6. Un método de cribado de un agente para una actividad farmacológica útil en el tratamiento de la DCL, que comprende:

poner en contacto un animal transgénico no humano que tiene un transgén que expresa un fragmento de alfa – sinucleína, tal y como se define en las reivindicaciones 1 o 2, con un agente; y determinar un nivel de formas agregadas del fragmento en el cerebro de un animal transgénico no humano con relación al nivel de referencia de las formas agregadas comparables a un animal transgénico no humano en ausencia del agente, una reducción en el nivel de las formas agregadas del fragmento en relación a la referencia indica que el agente tiene una actividad farmacológica útil en el tratamiento de la DCL, en el que el animal transgénico no humano es preferiblemente un ratón o una Drosophila.

7. Un método de cribado de un agente para una actividad farmacológica útil en el tratamiento de la DCL, que comprende:

poner en contacto un animal transgénico no humano que tiene un transgén que expresa alfa – sinucleína y procesa alfa – sinucleína en un fragmento, tal y como se define en las reivindicaciones 1 o 2, con un agente; y determinar un nivel del fragmento en una célula neuronal de un animal transgénico no humano con relación al nivel de línea en ausencia del agente, una reducción en el nivel de los fragmentos en relación a la referencia indica que el agente tiene una actividad farmacológica útil en el tratamiento de la DCL, en el que el animal transgénico no humano es preferiblemente un ratón o una Drosophila.

8. El método de las reivindicaciones 3 – 7, que comprende además la realización de un ensayo en un modelo animal no humano de DCL para determinar si el agente trata o inhibe un síntoma de la DCL, en el que la DCL es preferiblemente la enfermedad de Parkinson o la DCLD.

9. Un animal transgénico no humano, preferiblemente un ratón o una Drosophila, que tiene un genoma que comprende un transgén que comprende un promotor operablemente unido a un segmento de ácido nucleico que codifica un fragmento de alfa – sinculeína tal y como se define en las reivindicaciones 1 o 2; en el que la expresión del fragmento en el animal transgénico no humano predispone al animal no humano a desarrollar al menos una característica de DCL, en el que el promotor es preferiblemente un promotor PDGF, o en el que al menos una característica es preferiblemente una deficiencia de la función motora o una deficiencia de la función cognitiva.

10. Un método para detectar la presencia de la DCL en un paciente, que comprende:

detectar el nivel de un fragmento de alfa – sinucleína tal y como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 en el líquido cefalorraquídeo; un mayor nivel que el nivel de la referencia en individuos sin enfermedad que indica presencia de la DCL.

11. Un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento de alfa – sinucleína, tal y como se define en las reivindicaciones 1 o 2, sin unirse específicamente a una alfa – sinucleína completa, en el que el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo humano o humanizado, más preferiblemente un isotipo humano igG1.

12. Un método de diagnóstico de la presencia de DCL por imagen funcional in vivo, que comprende:

determinar un nivel de unión de un anticuerpo según la reivindicación 11 en el cerebro de un paciente, en el que un nivel más elevado de unión con relación al nivel de la referencia en individuos sin enfermedad indica la presencia de DCL.

13. Un fragmento de alfa – sinucleína, que se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, o un anticuerpo de alfa – sinucleína tal y como se define en la reivindicación 11, para su utilización en un método de tratamiento o profilaxis de la demencia con cuerpos de Lewy.