EXTRACTOS FENÓLICOS DE UNCARIA TOMENTOSA L. (UÑA DE GATO) QUE CONTIENEN PROCIANIDINAS, PROPELARGONIDINAS Y FLAVANOLIGNANOS, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES.

Extractos fenólicos de Uncaria tomentosa L. (uña de gato) que contienen procianidinas,

propelargonidinas y flavanolignanos, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

Esta invención se refiere a extractos fenólicos conteniendo procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos, con propiedades/actividades potencialmente beneficiosas para la salud humana, y obtenidos a partir de las partes aéreas y de la madera interna de la planta Uncaria tomentosa L, así como al procedimiento de obtención de dichos extractos. Estos extractos son útiles para elaborar aditivos alimentarios, composiciones cosméticas y composiciones farmacéuticas con actividad antioxidante, antimicrobian, citotóxica y antiproliferativa.

SECTOR DE LA TÉCNICA

Extractos fenólicos bioactivos de aplicación en la industria alimentaria, dietética, cosmética y farmacéutica.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las proantocianidinas o taninos condensados son oligómeros y polímeros de flavan-3-ol, que se encuentran entre los polifenoles más abundantes en nuestra dieta. Las proantocianidinas presentan una gran diversidad estructural, atendiendo a los siguientes factores: a) patrón de hidroxilación del anillo B; b) estereoquímica de las posiciones C2, C3 y C4 del anillo C (anillo central); c) tipo de enlace interflavánico; y d) grado de polimerización (DP) (Aron, P. M., y Kennedy, J. A. (2008). Flavan-3-ols: Nature, occurrence and biological activity. Molecular Nutrition and Food Research, 52(1), 79-104). Las unidades estructurales más comúnmente encontradas en las proantocianidinas de la dieta son (+)-afzelequina, (+)- catequina y (+)-galocatequina (formas 2R:3S) y sus diastereoisómeros (-)-epiafzelequina, (- )-epicatequina y (-)-epigalocatequina (formas 2R:3R), respectivamente. Algunas de las unidades constitutivas del polímero también pueden encontrarse esterificadas con el ácido gálico. Las proantocianidinas exclusivamente formadas por (epi)catequina se denominan procianidinas. Las propelargonidinas y prodelfinidinas contienen (epi)afzelequina y (epi)galocatequina, respectivamente, y por lo general, se encuentran combinadas con unidades de (epi)catequina en forma de heteropolímeros. En relación a la naturaleza del enlace ¡nterflavanánico, pueden existir diferentes regio- y estereo-isómeros. Las proantocianidinas de tipo B son aquellas en que las unidades monoméricas se encuentran enlazadas a través de la posición C4 de la unidad superior y de las posiciones C6 o C8 de la unidad terminal, siendo los isómeros C4-C8 más abundantes que los C4-C6, y adoptando usualmente la estereoquímica 3,4-trans. Adicionalmente, los flavan-3-oles también pueden

estar combinados con otras moléculas como los fenilpropanoides constituyendo derivados denominados flavanolignanos. Entre estos compuestos, cabe citar el grupo de las cinchonainas (la, Ib, le, Id), derivadas de la (-)-epicatequina (Tang, W., at al. (2007). Antioxidant phenylpropanoid-substituted epicatechins from Tríchilia catigua. Journal of 5 Natural Products, 70(12), 2010-2013).

OH

Cinchonaina la

Cinchonaina Ib

Cinchonaina Ic, C-9 (R) Cinchonaina Id, C-9 (S)

Considerando la abundancia de estos compuestos, las procianidinas de tipo B son las proantocianidinas más abundantes en el reino vegetal, encontrándose en frutas (uvas, manzanas, peras), legumbres, cacao y bebidas como el vino, sidra, té y cerveza; por otro lado las fuentes de propelargonidinas (i.e. fresa, frambuesa, piel de almendra, canela y algunas legumbres) y prodelfinidinas (grosella negra, uvas, avellana, pacana y pistacho) son más escasas (Gu, L., et al. (2003). Screening of Foods Containing Proanthocyanidins and Their Structural Characterization Using LC-MS/MS and Thiolytic Degradation. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(25), 7513-7521). De igual forma, la presencia de flavanolignanos en la naturaleza se limita a algunas plantas de uso medicinal (Qa'dan, F., at al. (2009). Cinchonain Ib isolated from Eríobotrya japónica induces insulin secretion in vitro and in vivo. Journal of Ethnopharmacology, 124(2), 224-227).

Las proantocianidinas presentan efectos potencialmente beneficiosos para la salud debido a sus propiedades antioxidantes, anti-carcinogénicas, cardioprotectoras, antimicrobianas y neuroprotectoras, (Aron, P. M. y J. A. Kennedy (2008). Flavan-3-ols: Nature, occurrence and biological activity. Molecular Nutrition and Food Research 52(1), 79-104) por lo que se emplean ampliamente como ingredientes funcionales en suplementos nutricionales. Los productos ricos en proantocianidinas más comercializados actualmente se obtienen de fuentes como la semilla de uva, manzana, cacao, corteza de pino, etc., las cuales contienen mayoritariamente procianidinas de tipo B.

En particular, las propelargonidinas presentan propiedades/actividades potencialmente beneficiosas para la salud humana, tales como resistencia frente a nemátodos (Collingborn, F. M. B., et al. (2000). Investigations into the biochemical basis for nematode resistance in roots of three Musa cultivars in response to Radopholus similis infection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(11), 5297-5301) y actividad fitoestrogénica (Eun, J. C., et al. (2003). Proliferative effects of flavan-3-ols and propelargonidins from rhizomes of

Drynaria fortunei on MCF-7 and osteoblastic cells. Archives of Pharmacal Research, 26(8), 620-630), jugando esta última un papel fisiológico importante en la prevención de enfermedades hormonales como la osteoporosis postmenopáusica.

Por otra parte, los flavanolignanos presentan propiedades antioxidantes superiores a algunos de sus precursores ((+)-catequina)(Tang, W., at al. (2007). Antioxidant phenylpropanoid-substituted epicatechins from Tríchilia catigua. Journal of Natural Products, 70(12), 2010-2013). También poseen efectos insulinotrópicos sugiriendo su posible uso para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (Qa'dan, F., at al.(2009). Cinchonain Ib isolated from Eriobotrya japónica induces insulin secretion in vitro and in vivo. Journal of Ethnopharmacology, 124(2), 224-227), así como actividad antibacteriana frente a bacterias patógenas (Pizzolatti, M. G., et al. (2002). Two epimeric flavalignans from Tríchilia catigua (Meliaceae) with antimicrobial activity. Zeitschrift fur Naturforschung - Section C Journal of Biosciences, 57(5-6), 483-488). Por otra parte, se destacan sus efectos protectores frente a la citotoxicidad inducida por hidroperóxido (Uchino, T., et al. (2004). Potent protecting effects of Catuaba (Anemopaegma mirandum) extracts against hydroperoxide-induced cytotoxicity. Toxicology In Vitro, 18(3), 255-263).

Ahora bien, la invención y desarrollo de productos ricos en compuestos potencialmente activos, requiere la búsqueda de fuentes naturales alternativas a las existentes que resulten sostenibles.

Linearía tomentosa L., conocida como uña de gato, rangayo o bejuco de agua, es una liana propia del bosque tropical lluvioso perteneciente a la familia Rubiaceae, y que se distribuye de forma natural desde Perú hasta Belice. El interés científico en esta planta se incrementó con la comprobación de sus propiedades estimulantes del sistema inmunológico, atribuida principalmente a su contenido en alcaloides (Steinberg, P. N. (1995). Cat's Claw: an herb from the Peruvian Amazon. Una de Gato: una hierba prodigiosa de la selva húmeda Peruana., 35-36). En la actualidad existe evidencia científica derivada de numerosos estudios farmacológicos que demuestran un gran rango de actividades incluyendo: anticancerígena, antimutagénica, anti-inflamatoria, antiviral, inmunomodulatoria y antioxidante, así como sus efectos a nivel del sistema cardiovascular, nervioso central y

locomotor (Heitzman, M. E., et al. (2005). Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Uncaría (Rubiaceae). Phytochemistry, 66(1), 5-29).

Estudios recientes sugieren que los compuestos fenólicos de la planta podrían ser responsables de algunos de los efectos farmacológicos de Uncaría tomentosa, aunque los mismos han recibido muy poca atención (Desmarchelier, C., et al. (1997). Evaluation of the in vitro antioxidant activity in extracts of Uncaría tomentosa (Willd.) DC. Phytotherapy Research, 11(3), 254-256; Sandoval, M., et al. (2002). Anti-inflammatory and antioxidant activities of cat's claw (Uncaría tomentosa and Uncaría guianensis) are independent of their alkaloid content. Phytomedicine, 9(4), 325-337). Entre los compuestos no-flavonoideos figuran mayoritariamente ácidos hidroxicinámicos... [Seguir leyendo]

1Extracto de la planta Linearía tomentosa L. obtenido a partir de cualquier parte aérea o de la madera interna de la misma, que presenta capacidad/actividad antioxidante, antimicrobiana, citotóxica y antiproliferativa, y caracterizado porque comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 80,7 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 11,3 mg de cloruro de cianidina/g,

c) un contenido mínimo de 0,88 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y

d) un porcentaje mínimo de monómeros del 2,2%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 5,7%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 1,1% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 1,9%.

2.- Extracto de la planta Linearía tomentosa L. según la reivindicación 1 caracterizado porque se obtiene de las hojas y porque comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 356 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 221 mg de cloruro de cianidina/g,

c) un contenido mínimo de 11,1 mg/g para la sumatoria total de mohómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y

d) un porcentaje mínimo de monómeros del 9,3%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 11,5%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 31,4% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 1,9%.

3.- Extracto de la planta Linearía tomentosa L. según la reivindicación 1 caracterizado porque se obtiene de los tallos y porque comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 286 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 299 mg de cloruro de cianidina/g,

c) un contenido mínimo de 11,9 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y

d) un porcentaje mínimo de monómeros del 6,4%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 57,9%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 18,0% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 9,1%.

4.- Extracto de la planta Linearía tomentosa L. según la reivindicación 1 caracterizado porque se obtiene de la corteza y porque comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 283 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 247 mg de cloruro de cianidina/g,

c) un contenido mínimo de 3,3 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y

d) un porcentaje mínimo de monómeros del 5,9%, un porcentaje de procianidinas del 57,9, un porcentaje de propelargonidinas del 6,0% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 11%.

5.- Extracto de la planta Linearía tomentosa L. según la reivindicación 1 caracterizado porque se obtiene de la madera interna y porque comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 80,7 de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 11,3 de cloruro de cianidina/g,

c) un contenido mínimo 0,88 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y

d) un porcentaje mínimo de monómeros del 2,2%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 5,7%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 1,1% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 33,1%.

6.- Procedimiento de obtención del extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5 que implica un fraccionamiento que permite obtener tres extractos diferenciados: un primer extracto no polar, un segundo extracto alcalóidico y tres extractos polifenólicos que provienen de extracciones de los anteriores extractos o de sus marcos y que en su conjunto constituyen un tercer extracto polifenólico enriquecido total de Linearía tomentosa L., y caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) una etapa de preparación del material vegetal que comprende la separación de las distintas partes aéreas y madera interna, una fase de secado y una fase de molienda de las mismas;

b) una etapa de maceración-extracción del material vegetal que comprende las siguientes fases:

b.1.- obtención del extracto no polar empleando una extracción sólido-líquido y disolventes orgánicos, preferentemente éter metil-ter-butílico, hexano, cloroformo y metanol,

tanto puros como mezclados; a una temperatura entre 5°C y 60°C, preferentemente entre 25°C y 30°C; durante un tiempo de extracción comprendido entre 8 y 72 horas; y que es llevado a sequedad a una temperatura inferior a 40°C;

b.2.- obtención del extracto polar polifenólico empleando una extracción sólido-líquido y disolventes orgánicos, preferentemente metanol; a una temperatura entre 5°C y 60°C, preferentemente entre 25°C y 30°C; y durante un tiempo de extracción comprendido entre 8 y 72 horas;

b.3.- obtención del extracto alcalóidico empleando una extracción sólido-líquido y siguiendo los siguientes pasos;

b.3.1.- empleo de disolventes orgánicos, preferentemente éter metil-ter-butílico y metanol, tanto solos como en combinación con amoniaco; a una temperatura entre 5°C y 60°C, preferentemente entre 25°C y 30°C; y durante un tiempo de extracción comprendido entre 8 y 72 horas,

b.3.2.- empleo de disolventes acidulados con ácidos de tipo inorgánico como HCI, H2S04, H3P04, o con cualquier ácido orgánico como ácido acético, cítrico o tartárico, b.3.3.- empleo de disolventes basificados con bases de tipo inorgánico, como carbonato de sodio o de tipo orgánico como amoniaco, hasta alcanzar un pH de 10, y b.3.4.- empleo de disolventes orgánicos como éter metil-ter-butílico,y b.3.5.- secado del extracto alcalóidico con agentes desecantes como sulfato de sodio y posteriormente llevado a sequedad utilizando temperaturas inferiores a 40°C; conservándolo para su tratamiento;

b.4.- obtención del extracto polifenólico total, constituido por el extracto obtenido en la fase de obtención del extracto polar polifenólico (b.2) y los extractos obtenidos mediante los siguientes pasos:

b.4.1.- después de la fase de obtención del extracto no polar (b.1), el extracto no polar obtenido se somete a extracción sólido-líquido con solventes orgánicos, preferentemente metanol, para obtener un extracto polifenólico con los polifenoles remanentes,

b.4.2.- después del paso de empleo de disolventes orgánicos (b.3.1), el marco alcalóidico se somete a extracción sólido-líquido con solventes orgánicos, preferentemente metanol, para obtener un extracto polifenólico con los polifenoles remanentes;

b.5.- secado del extracto polifenólico total (b.4) a temperatura inferior a 40°C;

c) una etapa de purificación del extracto polifenólico total (b.4), sea mediante extracción sólido-líquido con solventes orgánicos, como éter metil-ter-butílico y cloroformo, y/o

mediante cromatografía de fase reversa (RP) con polímeros no polares de adsorción- desorción tal como Diaion HP20 y/o mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o filtración en gel con medios tal como Sephadex LH-20, y

d) una etapa de secado del extracto polifenólico purificado (c) a temperatura inferior a 40°C.

7.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6, caracterizado porque en la etapa de preparación del material vegetal (6.a), la fase de secado se lleva a cabo colocando inicialmente el material vegetal en una superficie plana en un cuarto con ventilación durante 120 horas y, posteriormente, en una estufa a 40°C durante 72 horas.

8.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6, caracterizado porque la extracción sólido-líquido de la etapa de maceración-extracción (b) se realiza utilizando un sistema elegido de entre los siguientes: incubador, reflujo o baño de ultrasonidos.

9.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6 caracterizado porque para la obtención del extracto no polar(b.l) se utiliza una mezcla MTBE:MeOH (90:10 v/v).

10.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6 caracterizado porque para la obtención del extracto alcalóidico (b.3.1) se emplea una mezcla de amoniaco al 20% en MeOH.

11.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6, caracterizado porque para la obtención del extracto alcalóidico de la etapa de maceración-extracción en la que utilizan disolventes acidulados (b.3.2), los alcaloides se extraen con ácido tartárico al 20%, y en la etapa de empleo de disolventes basificados (b.3.3.), las fases acuosas se basifican hasta pH 10 con carbonato de sodio.

12.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6, caracterizado porque utiliza extracciones sólido-líquido de los extractos menos polares secos (b.4.1) y del marco alcalóidico (b.4.2) con solventes polares como metanol, y varias extracciones sólido-líquido con metanol de la muestra de la planta inicial.

13.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6 caracterizado porque en la etapa de purificación del extracto total polifenólico seco (c) se utiliza un procedimiento de extracción sólido-líquido con empleo de disolventes orgánicos como MTBE y/o cloroformo.

14.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6 caracterizado porque en la etapa de purificación del extracto total polifenólico seco (c) se utiliza una técnica seleccionada de entre las siguientes: purificación por extracción solido-liquido; cromatografía de adsorción sobre resinas tipo Diaion HP20 o cromatografía de exclusión por tamaño, sobre geles de filtración tipo Sephadex LH-20, por elución en gradiente de solventes de distinta polaridad, incluyendo agua y solventes orgánicos, como acetato de etilo, acetona, metanol, o sus mezclas en distintos porcentajes.

15.- Procedimiento de obtención del extracto según la reivindicación 6 caracterizado porque en la etapa de secado del extracto purificado (d), se utiliza una técnica seleccionada de entre las siguientes: liofilización, concentración y/o secado a vacío, secado con aire, concentración y secado con rotavapor, y atomización.

16.- Producto alimentario funcional caracterizado porque comprende un extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, útil para la prevención y tratamiento de procesos de envejecimiento fisiológico, procesos patológicos relacionados con la edad o con el estrés oxidativo.

17.- Producto alimentario funcional según la reivindicación 16, caracterizado porque presenta capacidad antioxidante, fitoestrogénica, insulinotrópica, antimutagénica, neuroprotectora, anticancerígena, anti-inflamatoria, antiviral y cardioprotectora.

18.- Composición cosmética caracterizada porque comprende un extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5 útil para la prevención y tratamiento de procesos de envejecimiento fisiológico, procesos patológicos relacionados con la edad o con el estrés oxidativo.

19.- Composición cosmética según la reivindicación 18, caracterizada porque presenta capacidad antioxidante, anticancerígena y anti-inflamatoria.

20.- Composición farmaceútica caracterizada por contener un extracto según una cualquiera 5 de las reivindicaciones 1 a la 5, útil para la prevención y tratamiento de tumores e

infecciones y cardioprotectora.

21.- Composición farmaceútica según la reivindicación 20, caracterizada porque presenta capacidad antioxidante, fitoestrogénica, insulinotrópica, antimutagénica, neuroprotectora,

anticancerígena, anti-inflamatoria, antiviral y cardioprotectora.