Expresión genéticamente programada de proteínas sulfatadas selectivamente en eubacterias.

Un sistema de traducción que comprende:

(a) un primer aminoácido no natural que es la sulfotirosina tal como se representa en la Figura 1;

(b) una primera aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) en donde la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de la SEC ID Nº: 2, la cual variante conservativa tiene una identidad de al menos el 90 % con la SEC ID Nº: 2 y comprende: una leucina en una posición correspondiente a Tyr32; una prolina en una posición correspondiente a Leu65; una glicina en una posición correspondiente a Asp158 y una lisina en una posición correspondiente a Leu162, y;

opcionalmente comprende un ácido glutámico en una posición correspondiente a Gln155 y/o una treonina o una cisteína en una posición correspondiente a Ile159, y;

(c) un primer ARNt ortogonal (O-ARNt); en el que dicha primera O-RS aminoacila dicho primer O-ARNt con dicha sulfotirosina.

Expresión genéticamente programada de proteínas sulfatadas selectivamente en eubacterias

Campo de la invención La invención pertenece al campo de la bioquímica de la traducción. La invención se refiere a composiciones y métodos para fabricar y utilizar ARNt ortogonales, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales, y pares de los mismos, que incorporan aminoácidos no naturales en proteínas. La invención también se refiere a métodos para producir proteínas en células utilizando dichos pares y proteínas fabricados por los métodos.

Antecedentes de la invención La sulfatación de la tirosina es una modificación postraduccional común en proteínas segregadas y unidas a membranas (Kehoe y Bertozzi, “Tyrosine sulfation: a modulator of extracellular protein-protein interactions, ” Chem Biol 7: R57-61 (2000) ) . Aunque estamos solo comenzando a comprender el grado de su función biológica, la sulfotirosina ya se ha identificado en diversos paradigmas de interacción proteína-proteína. Por ejemplo, la sulfatación de la tirosina desempeña una función determinante en la unión de quimiocinas a los receptores de quimiocinas CCR2 (Preobrazhensky et al., “Monocyte chemotactic protein-1 receptor CCR2B is a glycoprotein that has tyrosine sulfation in a conserved extracellular N-terminal region” J Immunol 165: 5295-5303 (2000) ) , CCR5 (Farzan et al., “Tyrosine sulfation of the amino terminus of CCR5 facilitates HIV-1 entr y ” Cell 96: 667-676 (1999) ) , CXCR4 (Farzan et al., “The role of post-translational modifications of the CXCR4 amino terminus in stromal-derived factor 1 alpha association and HIV-1 entr y , ” J Biol Chem 277: 29484-29489 (2002) ; Veldkamp et al., “Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factorlalpha (SDF-1alpha/CXCL12) , ” J Mol Biol 359:

1400-1409 (2006) ) y CX3CR1 (Fong et al., “CX3CR1 tyrosine sulfation enhances fractalkine-induced cell adhesion, ” J Biol Chem 277: 19418-19423 (2002) ) . De manera similar, leucocitos rodantes bajo tensión cortante hidrodinámica requieren sulfatación de PSGL-1 para la correcta unión y adhesión (Somers et al., “Insights into the molecular basis of leukocyte tethering and rolling revealed by structures of P- and E-selectin bound to SLe (X) and PSGL-1, ” Cell 103: 467-479 (2000) ) . La sulfatación de la tirosina está también implicada en la cascada de coagulación, habiéndose identificado en diversos factores de coagulación así como en inhibidores de trombina naturales tales como la hirudina, un anticoagulante segregado por sanguijuelas (Dong et al., “Tyrosine sulfation of the glycoprotein Ib-IX complex: identification of sulfated residues and effect on ligand binding, ” Biochemistr y 33: 13946-13953 (1994) ; Bagdy et al., “Hirudin, ” Methods Enzymol 45: 669-678 (1976) ) . Además, recientemente se descubrió que la sulfatación de la tirosina en una región bucle variable de anticuerpo era responsable de la actividad neutralizante de un subconjunto de anticuerpos del VHI-1 inducidos por CD4, demostrando de este modo la capacidad de la sulfotirosina para aumentar la afinidad antígeno anticuerpo (Choe et al., “Tyrosine sulfation of human antibodies contributes to recognition of the CCR5 binding region of HIV-1 gp120, ” Cell 114: 161-170 (2003) ; Xiang et al., “Functional mimicr y of a human immunodeficiency virus type 1 coreceptor by a neutralizing monoclonal antibody, ” J Virol 79: 6068-6077 (2005) ) .

Un obstáculo principal para la determinación de las funciones de la sulfatación en más de las 60 proteínas conocidas y más de las 2100 proteínas predichas que contienen sulfotirosina (según un estudio de secuencias de proteínas de ratón) es la capacidad de sintetizar selectivamente proteínas sulfatadas (Moore, “The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation, ” J Biol Chem 278: 24243-24246 (2003) ) . Los métodos actuales se basan en la síntesis 45 de péptidos convencional o en sulfatación enzimática in vitro (Veldkamp et al., “Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-lalpha (SDF-1alpha/CXCL12) , ” J Mol Biol 359: 1400-1409 (2006) ; Kirano et al., “Total synthesis of porcine cholecystokinin-33 (CCK-33) , ” J. Chem. Soc., Chem. Com-mun., 323-325 (1987) ; Muramatsu et al., “Enzymic O-sulfation of tyrosine residues in hirudins by sulfotransferase from Eubacterium A-44, ” Eur J Biochem 223: 243-248 (1994) ; Young y Kiessling, “A strategy for the synthesis of sulfated peptides, ” Angew Chem Int Ed Engl 41: 3449-3451 (2002) ) ; sin embargo, ambos carecen de generalidades: el primero está limitado por restricciones de longitud y la tendencia hacia la desulfatación de sulfotirosina en condiciones ácidas; el último está limitado por la disponibilidad de sulfotransferasas accesorias y sus restricciones de secuencias de reconocimiento asociadas.

La incorporación directa de un aminoácido no natural de sulfotirosina codificado genéticamente en sitios definidos en proteínas directamente en organismos vivos superaría las limitaciones descritas anteriormente. La incorporación directa de sulfotirosina facilitaría enormemente el estudio de acontecimientos de sulfatación en la regulación de procesos biológicos y también permitiría la creación de bibliotecas de anticuerpos y péptidos sulfatados de diversidad significativa. Adicionalmente, la capacidad para producir una forma sulfatada en la proteína hirudina tiene aplicación clínica inmediata para su uso como un anticoagulante mejorado (mejorado con respecto a la forma no sulfatada) . Lo que se necesita en la técnica son nuevas estrategias para incorporar en proteínas el aminoácido no natural sulfotirosina.

Se ha desarrollado una metodología general para la incorporación in vivo específica de sitio de diversos 65 aminoácidos no naturales en proteínas, en organismos tanto eucariotas como procariotas. Estos métodos se basan en componentes de traducción de proteínas ortogonales que reconocen un codón selector adecuado para insertar un aminoácido no natural deseado en una posición definida durante la traducción de polipéptidos in vivo. Estos métodos utilizan un ARNt ortogonal (O-ARNt) que reconoce un codón selector, y en el que una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (una O-RS) especifica correspondiente carga el O-ARNt con el aminoácido no natural. Estos componentes no reaccionan en cruzado con ninguno de los ARNt, RSs, aminoácidos o codones endógenos en el

organismo hospedador (es decir, debe ser ortogonal) . El uso de dichos pares ARNt-RS ortogonales ha hecho que sea posible codificar genéticamente una gran cantidad de aminoácidos no naturales estructuralmente diversos.

La práctica de utilizar sistemas de traducción ortogonal que son adecuados para la fabricación de proteínas que comprende uno o más aminoácidos no naturales es generalmente conocida en la técnica, como lo son los métodos 10 generales para producir sistemas de traducción ortogonal. Por ejemplo, véanse los Números de Publicación Internacional WO 2002/086075, titulada “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”; WO 2002/085923, titulada “IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”; WO 2004/094593, titulada “EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”; WO 2005/019415, presentada el 7 de julio de 2004; WO 2005/007870, presentada el 7 de julio 15 del 2004; WO 2005/007624, presentada el 7 de julio de 2004 y WO 2006/110182, presentado el 27 de octubre de 2005, titulada “ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”. Para un análisis adicional de sistemas de traducción ortogonal que incorporan aminoácidos no naturales, y métodos para su producción y uso, véase también, Wang y Schultz, “Expanding the Genetic Code, ” Chem. Commun. (Camb.) 1: 1-11 (2002) ; Wang y Schultz “Expanding the Genetic Code, ” 20 Angewandte Chemie Int. Ed., 44 (1) : 34-66 (2005) ; Xie y Schultz, “An Expanding Genetic Code, ” Methods 36 (3) : 227238 (2005) ; Xie y Schultz, “Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire, ” Curr. Opinion in Chemical Biology 9 (6) : 548-554 (2005) ; Wang et al., “Expanding the Genetic Code, ” Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 35: 225-249 (2006; epub 13 de junio de 2006) ; y Xie y Schultz, “A chemical toolkit for proteins -an expanded genetic code, ” Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7 (10) : 775-782 (2006; publicación electrónica 23 de agosto de 2006) . El documento WO 2004/035743

describe pares de ARNt/aminoacil ARNt sintetasa ortogonales... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de traducción que comprende:

(a) un primer aminoácido no natural que es la sulfotirosina tal como se representa en la Figura 1;

(b) una primera aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) en donde la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de la SEC ID Nº: 2, la cual variante conservativa tiene una identidad de al menos el 90 % con la SEC ID Nº: 2 y comprende: una leucina en una posición correspondiente a Tyr32; una prolina en una posición correspondiente a Leu65; una glicina en una posición correspondiente a Asp158 y una lisina en una posición correspondiente a Leu162, y; opcionalmente comprende un ácido glutámico en una posición correspondiente a Gln155 y/o una treonina o una cisteína en una posición correspondiente a Ile159, y;

(c) un primer ARNt ortogonal (O-ARNt) ; en el que dicha primera O-RS aminoacila dicho primer O-ARNt con dicha

sulfotirosina. 15

2. El sistema de traducción de la reivindicación 1, en el que:

(i) dicha primera O-RS deriva de una aminoacil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; y/o,

(ii) dicha primera O-RS deriva de una tirosil ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre; y/o

(iii) dicha primera O-RS comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nos: 4, 6, 8 o 10; y/o,

(iv) dicho primer O-ARNt es un ARNt supresor de ámbar; y/o

(v) dicho primer O-ARNt comprende o está codificado por una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEC

ID Nº: 1. 25

3. El sistema de traducción de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de interés, comprendiendo dicho ácido nucleico al menos un codón selector, en el que dicho codón selector es reconocido por dicho primer O-ARNt.

4. El sistema de traducción de la reivindicación 3, que adicionalmente comprende una segunda O-RS y un segundo O-ARNt, en el que la segunda O-RS aminoacila el segundo O-ARNt con un segundo aminoácido no natural que es diferente del primer aminoácido no natural, y en el que el segundo O-ARNt reconoce un codón selector que es diferente del codón selector reconocido por el primer O-ARNt.

5. El sistema de traducción de la reivindicación 1, en el que dicho sistema comprende una célula hospedadora que comprende dicho primer aminoácido no natural, dicha primera O-RS y dicho primer O-ARNt.

6. El sistema de traducción de la reivindicación 5, en el que dicha célula hospedadora es una célula de eubacteria, tal como una célula de E. coli.

7. El sistema de traducción de la reivindicación 5, en el que dicha célula hospedadora comprende un polinucleótido que codifica dicha primera O-RS y/o un polinucleótido que codifica dicho primer O-ARNt.

8. El sistema de traducción de la reivindicación 7, en el que dicho primer polinucleótido comprende una secuencia de 45 nucleótidos expuesta en las SEC ID Nos: 5, 7, 9 u 11.

9. Un método para producir, en un sistema de traducción, una proteína que comprende un aminoácido no natural en una posición seleccionada, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un sistema de traducción que comprende:

(i) un primer aminoácido no natural que es la sulfotirosina tal como se representa en la Figura 1;

(ii) una primera aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) en la que la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de la SEC ID Nº: 2, la cual dicha variante conservativa tiene

una identidad de al menos el 90 % con la SEC ID Nº: 2 y comprende: una leucina en una posición correspondiente a Tyr32; una prolina en una posición correspondiente a Leu65; una glicina en una posición correspondiente a Asp158, y una lisina en una posición correspondiente a Leu162, y; opcionalmente comprende un ácido glutámico en una posición correspondiente a Gln155, y/o una treonina o una cisteína en una posición correspondiente a Ile159;

(iii) un primer ARNt ortogonal (O-ARNt) , en el que dicha primera O-RS aminoacila dicho primer O-ARNt con dicha sulfotirosina; y

(iv) un ácido nucleico que codifica dicha proteína, en donde dicho ácido nucleico comprende al menos un codón selector que es reconocido por dicho primer O-ARNt; e 65 (b) incorporar dicho aminoácido natural en dicha posición seleccionada en dicha proteína durante la traducción de dicha proteína en respuesta a dicho codón selector, produciendo de este modo dicha proteína que comprende dicho aminoácido no natural en la posición seleccionada.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha proteína que comprende un aminoácido no natural es la sulfohirudina. 5

11. El método de la reivindicación 9, en el que:

(A) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar un polinucleótido que codifica dicha O-RS; o (B) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar una O-RS derivada de una aminoacil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii; o,

(C) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar una O-RS derivada de una tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre; o,

(D) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar una O-RS que comprende una 15 secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID Nos: 4, 6, 8 o 10; o,

(E) dicha disposición de un sistema de traducción comprende mutar un bolsillo de unión de aminoácidos de una aminoacil-ARNt sintetasa de tipo silvestre por mutagénesis de sitio dirigido y seleccionar una O-RS resultante que aminoacila dicho O-ARNt con dicho aminoácido no natural, en donde dicha etapa de selección comprende realizar una selección positiva y una selección negativa de dicha O-RS a partir de un conjunto que comprende una pluralidad de moléculas de aminoacil-ARNt sintetasa resultantes después de la mutagénesis de sitio dirigido; o,

(F) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar un polinucleótido que codifica dicho O-ARNt; o,

(G) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar un O-ARNt que es un ARNt supresor 25 ámbar; o,

(H) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar un O-ARNt que comprende o está codificado por una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1; o,

(I) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar un ácido nucleico que comprende un codón selector ámbar; o

(J) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar una célula hospedadora, en donde dicha célula hospedadora comprende dicho primer aminoácido no natural, dicha primera O-RS, dicho primer O-ARNt y dicho ácido nucleico, y en el que dicha etapa de incorporación comprende cultivar dicha célula hospedadora; o,

(K) dicha disposición de un sistema de traducción comprende proporcionar un extracto celular. 35

12. El método de la reivindicación 11 (J) , en el que:

(i) dicha disposición de una célula hospedadora comprende proporcionar una célula hospedadora de eubacteria; o (ii) dicha disposición de una célula hospedadora de eubacteria comprende proporcionar una célula hospedadora de E. coli; o,

(iii) dicha disposición de una célula hospedadora comprende proporcionar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que codifica dicha O-RS; o,

(iv) dicha disposición de una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que codifica dicha O-RS

comprende proporcionar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEC ID Nos: 5, 7, 9 u 11.

13. El método de la reivindicación 9, en el que adicionalmente dicha proteína comprende un segundo aminoácido no natural que es diferente de dicho primer aminoácido no natural, y en el que dicho sistema de traducción comprende 50 adicionalmente una segunda O-RS y un segundo O-ARNt, en donde la segunda O-RS aminoacila el segundo O-ARNt con un segundo aminoácido no natural que es diferente del primer aminoácido no natural, y en el que el segundo O-ARNt reconoce un codón selector en el ácido nucleico que es diferente del codón selector reconocido por el primer O-ARNt.

14. Una composición que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante conservativa de la SEC ID Nº: 2, la cual dicha variante conservativa tiene una identidad de al menos el 90 % con la SEC ID Nº: 2 y comprende: una leucina en una posición correspondiente a Tyr32; una prolina en una posición correspondiente a Leu65; una glicina en una posición correspondiente a Asp158, y una lisina en una posición correspondiente a Leu162, y;

opcionalmente comprende un ácido glutámico en una posición correspondiente a Gln155 y/o una treonina o una cisteína en una posición correspondiente a Ile159, y; el cual polipéptido aminoacila un O-ARNt con sulfotirosina tal como se representa en la Figura 1.

15. La composición de la reivindicación 14, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de las 65 SEC ID Nos: 4, 6, 8 o 10.

16. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de las reivindicaciones 14 o 15.

17. El polinucleótido de la reivindicación 16, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos

de las SEC ID Nº: 5, 7, 9 u 11. 5

18. La composición de las reivindicaciones 14 o 15, en donde dicha composición comprende una célula que comprende el polipéptido.

19. Un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 16. 10

20. Una célula que comprende un vector, comprendiendo el vector el polinucleótido de la reivindicación 16.

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos

SEC ID Nº: Descripción SECUENCIA

1 tirosil- ARNtCUA supresor de Methanococcus jannaschii tcc MjARNt-Tyr (CUA) o

2 Secuencia de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa (MjTyrRS) de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre

3 Secuencia de nucleótidos de la tirosil-ARNt sintetasa (MjTyrRS) de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre

4 CLON 1 Secuencia de aminoácidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa (derivada de la tirosil ARNt-sintetasa de Methanococcus jannaschiide de tipo silvestre)

Fig. 7

SEC ID Nº: Descripción SECUENCIA

5 CLON 1 Secuencia de nucleótidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa

6 CLON 2 Secuencia de aminoácidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa (derivada de la tirosil ARNt-sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre)

7 CLON 2 Secuencia de nucleótidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa

8 CLON 3 Secuencia de aminoácidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa (derivada de la tirosil ARNt-sintetasa de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre)

Fig. 7 (Cont.)

SEC ID Nº: Descripción SECUENCIA

9 CLON 3 Secuencia de nucleótidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa

10 CLON 4 Secuencia de aminoácidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa (derivada de la tirosil ARNt-sintetasa de Methanococcus jannaschii tipo silvestre)

11 CLON 4 Secuencia de nucleótidos de la sulfotirosina aminoacil-ARNt sintetasa

Fig. 7 (Cont.)