Espectrometria de masas de resistencias por betalactamasas.

Método para la determinación de resistencia a antibióticos betalactámicos de microbios basada en la síntesis microbiana de betalactamasas,

en el cual se añaden los microbios a un sustrato y se mide la degradación enzimática del sustrato causada por las betalactamasas de los microbios mediante espectrometría de masas, obteniendo así un espectro de masa del sustrato restante y del producto de degradación.

Espectrometría de masas de resistencias por betalactamasas

Sector de la invención

[1] La invención se refiere a la determinación de la resistencia de bacterias que producen betalactamasas, incluidas las «betalactamasas de espectro extendido» (BLEE).

Estado de la técnica

[2] Muchos tipos de microbios, en particular las bacterias y los hongos unicelulares, pueden identificarse fácilmente con espectrometría de masas mediante la transferencia de pequeñas cantidades de microbios de una colonia cultivada de la forma habitual sobre o en un medio nutritivo a una placa de soporte de muestras para espectrometría de masas, donde se preparan con una disolución de una matriz y se miden mediante espectrometría de masas tras la ionización por desorción láser asistida por matriz. El espectro de masa representa masas e intensidades de proteínas características en el caso de que estas estén presentes en los microbios en una concentración suficiente. Este espectro, que muestra picos de alrededor de 4 a 8 proteínas de los microbios cada vez, es utilizado para determinar su identidad mediante análisis de similitud con miles de espectros de referencia en las colecciones de espectros correspondientes. El término «identificación» denota aquí una clasificación taxonómica, por ejemplo la determinación de la familia, género y especie. La investigación se lleva a cabo en muchos lugares para cotejar las colecciones fiables y susceptibles de aprobación legal para aplicaciones médicas (las denominadas colecciones «homologadas») con espectros de referencia de miles de microbios.

[3] Este método de identificación de microbios ha demostrado una extraordinaria eficacia tanto para estudios como para la actividad diaria de numerosos laboratorios de microbiología. Es un método rápido, con costes reducidos y tasas de error muy bajas, muy inferiores a los métodos de identificación microbiana convencionales.

[4] Se pueden utilizar versiones especiales de estos métodos para identificar no solo especies microbianas sino a menudo también subespecies e incluso en ocasiones las cepas individuales, siempre que la masa o intensidad de las proteínas más frecuentes de estas cepas sea diferente y, por tanto, se pueda detectar mediante espectrometría de masas. Para una descripción más detallada, consultar la solicitud de patente DE 1 29 32 649 Al (T. Maier y M. Kostrzewa, 29, US

211/1216 Al; GB 2 471 746 A), por ejemplo, que no solo presenta una explicación detallada del método sino también un proceso de identificación más refinado.

[5] La identificación microbiana desempeña una función importante en las enfermedades infecciosas, en particular en el caso de una sepsis. En este caso es importante ser capaz de identificar las especies de microorganismos patógenos muy rápidamente, para así aplicar el tratamiento médico adecuado de forma inmediata. La identificación mediante espectrometría de masas se ha ensayado y probado también en estos casos, y actualmente está logrando aceptación en laboratorios clínicos y de microbiología.

[6] No obstante, en el campo médico no solo se hace frente al problema de una identificación rápida sino también al de la detección de resistencias a los antibióticos de uso habitual. Es imposible lograr una rápida lucha contra enfermedades infecciosas sin conocer las resistencias. Por este motivo no solo es preciso obtener una rápida identificación sino también determinar y caracterizar rápidamente las resistencias de los microorganismos. Se sabe que algunas especies microbianas poseen una resistencia casi total a ciertos antibióticos, por lo que tras una identificación precisa ya no tiene sentido determinar la resistencia. Sin embargo, en la mayoría de los casos las especies tienen algunas cepas que no son resistentes, otras con una resistencia reducida y en particular cepas con una gran resistencia, y además muestran diferentes grados de resistencia a diferentes tipos de antibióticos. Por ese motivo es esencial determinar el tipo y la intensidad de la resistencia.

[7] Parece lógico, por tanto, no limitar el uso de los espectrómetros de masas a la identificación taxonómica, sino utilizarlos también para determinar las resistencias de los microbios, en particular de las bacterias, a ciertos antibióticos. No obstante, esta labor se ha revelado muy complicada. Aunque las resistencias deben manifestarse también por la presencia de proteínas nuevas o modificadas, aún no se ha logrado una identificación directa a partir del perfil proteínico resultante de la espectrometría de masas. Al fin y al cabo, de los cientos o incluso miles de proteínas de los microbios en el espectro de masa solo aparecen de 4 a 8 de ellas. Por lo tanto, la resistencia debe determinarse de forma indirecta. En el documento DE 1 26 21 493 B4 (V. Govorun y J. Franzen; GB 2 438 66 B; US 28/929 Al) se presenta un primer intento de una determinación de la resistencia de este tipo, si bien este método aún no está aceptado. El método se basa fundamentalmente en la modificación de los perfiles proteínicos provocada por la muerte

celular tras la adición de antibióticos o en la detección de una interrupción del crecimiento en comparación con los microbios resistentes de referencia.

[8] El término «resistencia a los antibióticos» se utiliza para referirse a características de microorganismos (aquí principalmente bacterias) que les permiten mitigar o neutralizar por completo el efecto de los principios activos antibióticos. Las resistencias están ahora muy extendidas; en EE. UU. en tomo al 7 % de los microbios infecciosos adquiridos en hospitales son resistentes al menos a un antibiótico. Con frecuencia los pacientes se contagian con cepas bacterianas resistentes a varios antibióticos (multirresistencia). Las denominadas bacterias problemáticas son el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), el género Pseudomonas, la Escherichia coli con resistencia por BLEE y el Mycobacterium tuberculosis. Los cálculos realizados por los CDC (Centros para el Control y Prevención de Enfermedades) indican que en el año 24 se adquirieron en los hospitales de EE. UU. dos millones de infecciones con alrededor de 9 muertes, una cifra muy superior a la de muertes por accidentes de carretera, domésticos o industriales.

[9] Habitualmente el término «antibiótico» se refiere a fármacos o productos farmacéuticos empleados para el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas. El enorme éxito de los antibióticos en el campo de la medicina comenzó con la penicilina. El éxito de la penicilina, así como la aparición de las primeras resistencias, llevó a los investigadores a buscar y descubrir muchos más antibióticos: estreptomicina, cloranfenicol, aureomicina y tetraciclina, entre muchos otros. La mayoría de los antibióticos conocidos actualmente derivan de sustancias naturales. En el lenguaje coloquial la penicilina se utiliza ahora como sinónimo de antibiótico.

[1] La penicilina es un antibiótico betalactámico. Estos antibióticos betalactámicos se fijan a la proteína fijadora de la penicilina (PFP), un peptidoglicano con actividad transpeptidasa responsable de la formación de enlaces peptídicos para reforzar las paredes celulares. Los enlaces entre los antibióticos betalactámicos y la PFP inhiben a la PFP. Una cantidad insuficiente de PFP activa provoca lesiones en la pared celular a medida que las bacterias crecen; así, la membrana pierde el control de su permeabilidad y la capacidad de regular la concentración en el citoplasma. Tras un breve intervalo de tiempo la bacteria se vuelve inviable. Bajo condiciones extremas, en el laboratorio se puede observar cómo las células bacterianas «estallan» literalmente. Esta es la forma como los antibióticos betalactámicos actúan como bactericidas.

[11] Desde las primeras aplicaciones de la penicilina las bacterias han ido desarrollando diferentes tipos de resistencias a ritmo creciente. Un tipo importante de resistencia bacteriana a los antibióticos betalactámicos consiste en la síntesis de unas enzimas (las betalactamasas) que catalizan la hidrólisis del anillo betalactámico, rompiéndolo e inhibiendo así su acción. Actualmente se conocen más de 34 variantes de betalactamasas sintetizadas por muchos tipos de bacterias. Pueden dividirse en diferentes clases en función de su estructura general o su forma de actuación. La información genética para la síntesis de la enzima, originada por unas mutaciones, es heredada por cromosomas o por plásmidos. La información plasmídica puede transmitirse entre bacterias mediante diversos mecanismos, incluso entre bacterias de diferentes especies por contacto («transmisión horizontal»). En función de la acción de las betalactamasas... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación de resistencia a antibióticos betalactámicos de microbios basada en la síntesis microbiana de betalactamasas, en el cual se añaden los microbios a un sustrato y se mide la degradación enzimática del sustrato causada por las betalactamasas de los microbios mediante espectrometría de masas, obteniendo así un espectro de masa del sustrato restante y del producto de degradación.

2. Método según la reivindicación 1, en el cual las moléculas del sustrato contienen un anillo betalactámico.

3. Método según la reivindicación 2, en el cual el sustrato es un antibiótico betalactámico o un derivado betalactámico.

4. Método según la reivindicación 1, en el cual el sustrato tiene una masa molecular de entre 7 y 12 unidades de masa atómica.

5. Método según la reivindicación 1, en el cual el sustrato tiene un efecto antibiótico débil.

6. Método según la reivindicación 1, en el cual las moléculas del sustrato contienen un grupo enlazante que puede utilizarse para extraerlas de disoluciones.

7. Método según la reivindicación 6, en el cual el grupo enlazante es una biotina o un marcador de hexahistidina.

8. Método según la reivindicación 1, en el cual la degradación de varios tipos de sustrato se mide de forma simultánea.

9. Método según la reivindicación 8, en el cual los diferentes tipos de sustrato se preparan a medida para que sus patrones de degradación permitan la identificación de diferentes clases de betalactamasas.

1. Método según la reivindicación 9, en el cual los diferentes sustratos en tomo al anillo betalactámico imitan las formas estéricas de diferentes antibióticos.

11. Método según la reivindicación 1, en el cual se miden las velocidades de degradación de los sustratos.

12. Método según la reivindicación 1, en el cual los microbios se han obtenido a partir de la sangre

o de un hemocultivo.

13. Método según la reivindicación 1, donde se miden las cantidades de sustrato restante y su producto de degradación mediante espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida por matriz.

14. Método para la determinación de una resistencia a antibióticos betalactámicos de microbios

basado en la síntesis microbiana de betalactamasas, que comprende los siguientes pasos:

(a) Añadir los microbios a la disolución de al menos un sustrato que pueda ser degradado por las betalactamasas.

(b) Incubar la disolución a una temperatura especificada durante un tiempo especificado.

(c) Separar la disolución con el sustrato restante y su producto de degradación de los microbios,

(d) Obtener un espectro de masa de la disolución.