Ensayo FACS de ADCC de NK en 3D.

Un método para la detección in vitro de la función efectora de un anticuerpo,

que comprende la incubación de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citolíticos naturales con el anticuerpo.

Ensayo FACS de ADCC de NK en 3D

En el presente documento se describe un novedoso ensayo FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, clasificación de células activadas por fluorescencia) de citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC, Antibody Dependent Celular Citotoxicity) basado en un esferoide o en un agregado tridimensional formado por células de linfoma y linfocitos citolíticos naturales. Este ensayo es útil para el análisis funcional in vitro de inmunoglobulinas terapéuticas en formato sencillo así como en formato a alto rendimiento.

Antecedentes de la invención Los cultivos monocapa de líneas de células tumorales establecidas se utilizan frecuentemente en la investigación de biología tumoral básica y en el desarrollo de fármacos antitumorales. Sin embargo, un modelo de cultivo plano en dos dimensiones, refleja insuficientemente la arquitectura del tumor en tres dimensiones (3D) . Por tanto, aspectos específicos, relacionados con el desarrollo in vivo de gradientes de difusión de solutos, solo pueden estudiarse en un sistema de cultivo tridimensional tal como, por ejemplo, el modelo de esferoide o agregado tumoral multicelular. Los esferoides o agregados tumorales imitan regiones tumorales avasculares, caracterizadas por un aporte limitado de nutrientes debido a barreras de difusión a través de capas multicelulares.

Sin embargo, en la investigación, el uso extendido de los cultivos en 3D, está limitado por una generación y manipulación inapropiadas. Por tanto, se desarrolló un método sencillo y rápido para generar esferoides o agregados individuales en un cultivo en suspensión en forma de alto rendimiento. En pocillos individuales de una placa de 96 pocillos, en un período de cultivo de 24 horas, pueden generarse esferoides o agregados individuales 25 con tamaños iguales y una geometría esférica homogénea. Se trata de un formato de cultivo estandarizado con fácil acceso para la manipulación de compuestos y la recogida de esferoides para la realización de análisis posteriores. Un tamaño y geometría uniformes garantizan el desarrollo de gradientes de difusión casi idénticos en cada esferoide o agregado (Ivascu, A. and Kubbies, M., J. Biomol. Screening 11 (2006) 922-932) . El protocolo de generación de esferoides conocido incluye la adición de un extracto de membrana basal murina (rBM) , una mezcla de proteínas de matriz extracelular que induce una compactación del agregado a un esferoide.

Inami, K., et al. describen la actividad antitumoral de un anticuerpo monoclonal anti-C-ERC/mesotelina in vivo (Cancer Sci. 101 (2010) 969-974) .

Sumario de la invención Con la combinación de células tumorales y linfocitos citolíticos naturales en un esferoide o agregado tridimensional, se ha descubierto que la evaluación de inmunoglobulinas puede realizarse, por un lado, de forma más parecida al modo in vivo, y, por otro lado, que resulta ser adecuada para realizar análisis de alto rendimiento.

Un primer aspecto descrito en el presente documento es un método para la detección in vitro de la función efectora de un anticuerpo que comprende la etapa de incubar, con la inmunoglobulina, un esferoide o un agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citolíticos naturales.

En una realización, el método comprende las siguientes etapas:

a) marcar células diana tumorales con un primer colorante fluorescente, b) mezclar linfocitos citolíticos naturales y células diana tumorales, c) añadir a un pocillo de una placa multipocillo, aproximadamente 104 células por 200 !l, d) centrifugar la placa multipocillo e iniciar así la formación de un esferoide celular tridimensional, e) añadir la inmunoglobulina a los pocillos de la placa multipocillo, f) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas a aproximadamente 72 horas, g) marcar las células muertas en los pocillos con un segundo colorante fluorescente, y i) analizar las células en los pocillos de la placa multipocillo por clasificación de células activadas por

fluorescencia (FACS) y detectar así la función efectora del anticuerpo.

En una realización, los linfocitos citolíticos naturales son linfocitos citolíticos naturales humanos y tienen una pureza del 90% o superior. En una realización adicional, los linfocitos citolíticos naturales y las células diana tumorales se mezclan en una relación de 10:1 a 1:10. En una realización adicional, la relación es de 1:3 a 1:10. En otra realización, la relación es de 1:2 a 1:4. En una realización, la centrifugación se realiza durante 10 min. de 100 a 1.000 rpm. En una realización adicional, la centrifugación se realiza a aproximadamente 1.000 rpm. En una realización, el segundo colorante fluorescente es yoduro de propidio. En una realización, la incubación se realiza durante aproximadamente 20 horas a aproximadamente 28 horas.

En una realización, las células tumorales son células de linfoma. En otra realización, la célula de linfoma se selecciona del grupo que comprende células Raji, células SUDHL4, y células Z138. En otra realización, el anticuerpo se añade al pocillo a una concentración final de 100 !g/ml a 0, 001 !g/ml. En una realización adicional, el anticuerpo se añade al pocillo a una concentración final de 20 !g/ml a 0, 1 !g/ml. En una realización, el anticuerpo se añade al pocillo a una concentración final de 8 !g/ml a 12 !g/ml.

Un aspecto adicional descrito en el presente documento es el uso de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citolíticos naturales para el análisis de alto rendimiento de la combinación de una multitud de anticuerpos y una multitud de células tumorales.

Otro aspecto descrito en el presente documento es un método para determinar in vitro un anticuerpo con función efectora que comprende:

a) proporcionar al menos un anticuerpo, b) marcar células tumorales con un primer colorante fluorescente, c) mezclar linfocitos citolíticos naturales y células diana tumorales,

d) añadir a los pocillos de una placa multipocillo aproximadamente 104 células por 200 !l, e) centrifugar la placa multipocillo e iniciar así la formación de un esferoide celular tridimensional, f) añadir cada uno de los anticuerpos proporcionados a un pocillo individual de la placa multipocillo, g) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas a aproximadamente 72 horas h) marcar las células muertas en cada uno de los pocillos incubados con un segundo colorante fluorescente, i) analizar cada pocillo de la placa multipocillo por clasificación de células activadas por fluorescencia, y j) determinar el anticuerpo con la mayor relación o con una relación mayor de 1 de células muertas con respecto a células viables como anticuerpo con función efectora.

Así mismo, un aspecto descrito en el presente documento es un kit que comprende:

a) una célula tumoral marcada con un colorante fluorescente, b) linfocitos citolíticos naturales aislados, c) una placa multipocillo de 96 pocillos, y d) yoduro de propidio.

En una realización, la placa multipocillo es una placa multipocillo de 96 pocillos.

Descripción detallada de la invención En el presente documento se describe una tecnología analítica celular basada en el uso de un ensayo de co-cultivo de esferoides o agregados tridimensional, en el que los esferoides o agregados comprenden células tumorales y linfocitos citolíticos naturales. Este ensayo es útil en una realización para el análisis funcional in vitro de inmunoglobulinas en formato sencillo y de alto rendimiento. En una realización, un esferoide o agregado tridimensional sencillo se coloca en cada pocillo de una placa multipocillo de fondo redondo de 96 pocillos que se ha recubierto con poliHEMA, ácido (poli (hidroxietil metacrílico) ) . En una realización adicional, los linfocitos citolíticos naturales son linfocitos citolíticos naturales (NK, por las siglas en inglés Natural Killer) humanos diploides normales. En una realización, los linfocitos NK se han seleccionado aplicando una técnica de selección negativa, es decir, las células no se tocan durante la etapa de la selección (véanse, por ejemplo, Horgan, K. et al., Curr. Prot. Immunol. (2009) , capítulo 7, unidad 7.4. Immunomagnetic purification of T cell subpopulations, y Neurauter, A.A., et al., Adv.

Biochem. Eng. Biotechnol. 106 (2007) 41-73) . Se ha descubierto que, con estos linfocitos NK, es posible cuantificar porcentajes correctos de células viables y muertas.

La mayoría de los experimentos realizados in vitro en el campo de la biología tumoral se realizan con cultivos monocapa ya que son fáciles y cómodos de manejar. Sin embargo, aunque proporcionan un modelo... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección in vitro de la función efectora de un anticuerpo, que comprende la incubación de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citolíticos naturales con el 5 anticuerpo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

a) mezclar linfocitos citolíticos naturales y células tumorales, 10 b) añadir aproximadamente 104 células por 200 !l a los pocillos de una placa multipocillo,

c) centrifugar la placa multipocillo e inducir así la formación de un esferoide o agregado tridimensional,

d) añadir el anticuerpo a los pocillos de la placa multipocillo,

e) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas a aproximadamente 72 horas,

f) analizar las células en los pocillos de la placa multipocillo por clasificación de células activadas por 15 fluorescencia y detectar así la función efectora del anticuerpo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que los linfocitos citolíticos naturales son linfocitos citolíticos naturales humanos.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los linfocitos citolíticos naturales y las células tumorales se mezclan en una relación de 10:1 a 1:10.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que la relación es de 1:2 a 1:4.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la incubación se realiza durante aproximadamente 20 horas a aproximadamente 28 horas.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado por que la centrifugación se realiza a 1.000 rpm durante 10 min. 30

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la célula tumoral es una célula de linfoma.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la célula de linfoma es una célula Raji o una 35 célula SU-DHL4 o una célula Z138.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado por que el anticuerpo se añade a una concentración de 15 !g/ml a 0, 1 !g/ml.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que el anticuerpo se añade a una concentración de 8 !g/ml a 12 !g/ml.

12. El uso de un esferoide o agregado tridimensional que comprende células tumorales y linfocitos citolíticos naturales para la determinación de la función efectora de una combinación de una multitud de anticuerpos con una 45 multitud de células tumorales.

13. Un método para determinar in vitro un anticuerpo con función efectora que comprende a) mezclar linfocitos citolíticos naturales y células tumorales, 50 b) añadir aproximadamente 104 células por 200 !l a los pocillos de una placa multipocillo,

c) centrifugar la placa multipocillo e inducir así la formación de un esferoide o agregado tridimensional,

d) añadir cada uno de los anticuerpos proporcionados a un pocillo individual de la placa multipocillo,

e) incubar la placa multipocillo durante aproximadamente 20 horas a aproximadamente 72 horas, y

f) determinar el anticuerpo con una relación de más de 1 célula muerta con respecto a células viables como 55 anticuerpo con función efectora.

14. Un kit que comprende:

a) una célula tumoral marcada con un colorante fluorescente, 60 b) linfocitos citolíticos naturales aislados,

c) una placa multipocillo de 96 pocillos, y

d) yoduro de propidio.