Procedimiento para el diagnóstico clínico de una enfermedad infecciosa basada en el empleo de la PCR cuantitativa, oligonucleótidos marcados de 8 a 9 nucleótidos de longitud y la UNG del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua).

La presente invención proporciona un procedimiento, útil para su uso en un laboratorio de microbiología clínica,

que permite la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo en una muestra Biológica de un sujeto con un alto grado de fiabilidad utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real. Dicho procedimiento comprende los siguientes pasos:

a. Llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real con la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ ID No 3 o con una variante de la misma; y

b. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado a), a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) de la muestra biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo, preferiblemente dicha sonda presenta una longitud de 8 nucleótidos.

Procedimiento para el diagnóstico clínico de una enfermedad infecciosa basada en el empleo de la P (R cuantitativa, oligonucleótidos marcados de 8 a 9 nucleótidos de longitud y la UNG del Bacalao del Atlántico (Gadus morhual.

Campo de la técnica La presente invención se refiere al campo del diagnóstico clínico. Más concretamente al diagnóstico clínico mediante la utilización de la técnica de la PCR en tiempo real con sondas marcadas fluorescentemente constituidas por oligonucleótidos con una longitud entre 8 y 9 nucleótidos.

Antecedentes de la invención La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona simplemente para ayudar al lector a comprender la invención y no se reconoce que describa o constituya técnica anterior de la presente invención.

Hoy en día el diagnóstico mediante técnicas moleculares ha cambiado la práctica clínica en relación a las enfermedades infecciosas. En este sentido, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica molecular más desarrollada actualmente y tiene un amplio abanico de posibilidades, entre las que se incluyen la detección de diversos patógenos, la individualización de nuevos agentes infecciosos o el seguimiento de la prevalencia de diversas enfermedades infecciosas en la población. Así, la PCR cuantitativa o en tiempo real se está aplicando hoy en día en tres grandes campos clínicos:

L En el diagnóstico clínico o etiológico, donde la PCR es muy útil sobre todo en ausencia de métodos de diagnóstico alternativos o cuando éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnóstica complementando métodos convencionales o si se requiere un diagnóstico rápido y precoz del agente etiológico que permita iniciar el tratamiento específico lo antes posible.

2. En el control del tratamiento, donde la PCR se utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, para lo cual es importante disponer de métodos cuantitativos.

3. En la caracterización genética del microorganismo (genotipificación) e identificación de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de virulencia.

Así, la utilización de la técnica de la PCR en tiempo real en los laboratorios de Microbiología Clínica supone un avance muy significativo en el campo del diagnóstico clínico, el control del tratamiento así como en la genotipificación. Adicionalmente, ésta técnica se vería notablemente mejorada con la utilización de sondas (en ingles "probes") cortas, es decir sondas marcadas fluorescentemente con una longitud de 8 a 9 nucleótidos (ntl. Esto es debido por un parte a su gran variabilidad y por otra al hecho en sí que la utilización de la PCR a tiempo real utilizando sondas cortas presenta la necesidad de utilizar un rango de tamaño específico de los transcritos (de aquí en adelante amplicones) amplificados.

Así, es importante matizar que dichos amplicones deben poseer un tamaño entre 60 y 120 nucleótidos para que de esta forma se incremente la eficiencia de la amplificación y se reduzca el tiempo de reacción. La razón para ello es porque los fragmentos pequeños se desnaturalizan más facilmente que aquellos fragmentos más grandes (> 120 nucleótidos) a una temperatura de 95D y exigen de un menor tiempo de reacción. De esta forma es conocido en el estado de la técnica que la eficiencia de amplificación es menor cuanto mayor sea el tamaño del amplicon. Por lo tanto, se recomienda la amplificación de transcritos que presenten un tamaño entre 50 y 150 nucleótidos, mas concretamente entre 60 y 120 nuc1eótidos, aún más concretamente entre 70 y 110 nucleótidos cuando se utilizan sondas cortas. De hecho, la utilización de sondas cortas (8-9 nucleótidos) , amplifican en su mayoría fragmentos comprendidos entre 70 y 110 nucleótidos siguiendo indicaciones del software Primer3

(http://primer3.sourceforge.netf) utilizando los ajustes optimizados de forma predeterminada,

presentando la temperatura de fusión de ambos cebadores ajustada a 59-61 o C y la longitud del cebador fijada en 18-27 nucleótidos. Además, la utilización de dicha longitud de amplicones (70-110 nucleótidos) permite una adecuada eficiencia de amplificación aumentando la sensibilidad del diagnóstico etiológico en muestras clínicas.

Sin embargo, el empleo de esta longitud de amplicon y sondas cortas presenta una importante limitación, los falsos positivos producidos como resultado de la contaminación resultante de las amplificaciones realizadas previamente en los laboratorios de Microbiología clínica (en inglés "carr y overJ/) . Así, se ha de tener en cuenta que más de un 90% de los amplicones que detectan las sondas cortas se encuentran en un rango entre 70-110 nucleótidos, y que su total eliminación como posibles contaminantes resulta imprescindible para garantizar la seguridad de trabajar con este sistema en los laboratorios de Microbiología Clínica. No obstante, la total eliminación de dichos amplicones en un rango entre 70-110 nucleótidos resulta sumamente complicado en un laboratorio de Microbiología Clínica.

Así, hay que tener en cuenta que la limitación del uso de material o la separación física de unidades de trabajo en los laboratorios de Microbiología Clínica no garantiza la total eliminación de los contaminantes (en ingles "carr y over contamination") . Entre otras cosas, porque de hecho, dichos contaminantes se transmiten principalmente por el propio personal técnico del laboratorio y porque estos contaminantes pueden permanecer en muchas superficies largos períodos de tiempo cuando no son sistemáticamente identificados y descontaminados después de cada contacto potencial con los productos de PCR, lo cual en la clínica diaria resulta complicado de llevar a cabo.

Adicionalmente, hay que tener en cuenta que los contaminantes de ADN localizados en los equipos y pipetas son de difícil descontaminación con UV (radiación ultravioleta) presumiblemente debido a que es menos eficaz con el ADN seco y que esta técnica no es ni siquiera eficaz en aquellos amplicones de pequeño tamaño, por ejemplo de 73 nucleótidos. Además, no es posible establecer un protocolo de eliminación de amplificaciones de ADN contaminantes de pequeño tamaño (73 nucleótidos) para PCR cuantitativas o en tiempo real, ya que requiere aplicación de luz UV durante 10 min a corta distancia solo del Buffer que forma parte de la mez.cla de reacción, no siendo aplicable ni a oligonucleótidos, ni a la Taq polimerasa, ni a los cebadores.

Por todo ello, encontrar una solución rápida y sencilla que perm ita la adecuada eliminación de estos amplicones de pequeño tamaño (que como anteriormente hemos comentado son los que permiten una mayor eficiencia de amplificación, y por tanto sensibilidad diagnóstica) permitiría el diagnóstico con gran sensibilidad y especificidad de numerosas enfermedades infecciosas, trabajando con la técnica de PCR a tiempo real con sondas cortas en los laboratorios de Microbiología Clínica.

Breve description de la invención Por lo tanto, la presente invención resuelve las limitaciones existentes a la hora de trabajar con la técnica de la PCR a tiempo real con sondas cortas y amplicones de pequeño tamaño en el campo del diagnóstico clínico. Para ello, en un primer aspecto de la presente invención proponemos un procedimiento, útil para su uso en un laboratorio de Microbiología Clínica, que permite la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo en una muestra Biológica de un sujeto con un alto grado de fiabilidad

utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real.

Dicho procedimiento comprende los siguientes pasos:

a. llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo

la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo

real con la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua)

de SEQ ID No 3 o con una variante de la misma; y

b. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra Biológica, t ras

tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado a) , a través de la determinación

de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó

ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) de la muestra Biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinación de la presencia o ausencia de un microorganismo en una muestra biológica de un sujeto a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real, que comprende:

a. llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real con la Uraci1+ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua)

de SEQ ID No 3; y

b. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras el

tratamiento de la mezcla de reacción según el apartado al, a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) , de la muestra biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la sonda marcada fluorescentemente consiste en 20 un oligonudeótido con una longitud de 8 nucleótidos.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 60 y 120 nucleótidos.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 70 y 110 nucleótidos.

5. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la sonda marcada fluorescentemente es una sonda Taqman.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto es un humano.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el microorganismo 30 es un patógeno.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, donde el patógeno se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Virus de la Varicela Zoster, Bordeteffa pertussis, Bordetella holmensii, el complejo Mycobacterium

tuberculosis, Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.

9. Procedimiento para diagnosticar una patología causada por un microorganismo en base a la presencia o ausencia de dicho microorganismo en una muestra biológica de un sujeto, que comprende:

a. Toma de muestra biológica de un sujeto;

b. Preparar una mezcla de reacción que permita determinar la presencia o ausencia del

microorganismo en la muestra biológica a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

c. Llevar a cabo un tratamiento de la mezcla de reacción que se utilizará para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real con la Uracil~ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ ID No 3; y

d. Determinar la presencia o ausencia del microorganismo en la muestra biológica, tras tratam iento de la mezcla de reacción según el apartado c) , a través de la determinación de la presencia o ausencia de amplicones procedentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada de forma cuantitativa en tiempo real;

donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) emplea ADN, ADN complementario (ADNc) ó ADN de hebra simple obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN) , de la muestra biológica, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable y una sonda marcada fluorescentemente, donde dicha sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleótido con una longitud de 8 a 9 nucleótidos marcado con un fluoroforo.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, donde la sonda marcada fluorescentemente consiste en un oligonucleót ido con una longitud de 8 nucleótidos.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 ó I D, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa 25 (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 60 y 120 nucleótidos.

12. El procedimiento de la reivindicación 9 ó I D, donde dicha reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica amplicones con una longitud entre 70 y 110 nucleótidos.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde la sonda marcada fluorescentemente es una sonda Taqman.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde el sujeto es un humano.

15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde el microorganismo es un patógeno.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, donde el patógeno se selecciona de la lista que consiste en Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Virus de la ES 2 449 665 A2

Varicela Zoster, Bordeteffa pertussis, Bordetelfa hofmensii, el complejo Mycobacterium

tuberculosis, Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.

17. Un kit útil para la determinación de la de la presencia o ausencia de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos los siguientes e lementos:

a. la Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEQ IDNo3;y

b. Sonda marcada fluorescentemente con una longitud de 8 a 9 nucleótidos.

18. El kit según la reivindicación 17, que además comprende al menos uno de los siguientes elementos: un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN

polimerasa termoestable.

19. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 Ó 18, donde el microorganismo a identificar y la sonda se seleccionan de una cualquiera de las opciones de la siguiente lista:

a. Bordetefla pertussis y la sonda marcada con un fluoroforo de SEQ ID No 4;

b. Bordetefla holmensii y la sonda marcada con un fluoroforo de SEQ ID No 5;

c. Complejo Mycobacterium tuberculosis y la sonda marcada can un fluor%ro de SEQ /0 No 6;

d. Streptococcus pneumoniae y la sonda marcada con un fluor%ro de /0 No 7;

e. Neisseria meningitidis y la sonda marcada con un /fuoroforo de ID No 8;

f. Listeria monocytogenes y /0 sonda marcada con un I/uor%ro de ID No 9;0

g. Streptococcus agalactiae y la sonda marcada con un fluoroforo de ID No 10.

20. Un kit adecuado para el diagnóstico de la tosferina, que comprende al menos los siguientes elementos:

a. l a Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) de SEO IDN03; y

b. l as sondas marcadas con un fluor%ro de SEO ID No 4 y SEO ID No S.

21. Un kit adecuado para el diagnóstico de la meningitis bacteriana, que comprende al menos los siguientes elementos:

a. La Uracil-ADN-Glicosilasa procedente del Bacalao del Atlántico (Gadus morhua) ; y

b. las sondas marcadas con un fluoroforo de SEO ID No 8, SEO ID No 9, SEO ID No 7 y SEO ID No 10.

22. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 Ó 21, que además comprende al menos uno de los siguientes elementos: un par de cebadores especificos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, una ADN polimerasa termoestable.

23. El kit segú n cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que además comprende un control 5 positivo, preferiblemente B-globina.