Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal utilizando secuenciación genómica.

Un método para realizar el diagnóstico prenatal de una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra biológicaobtenida de un sujeto femenino gestante con un feto,

en el que la muestra biológica incluye moléculas de ácidonucleico libres de células del sujeto femenino y del feto, comprendiendo el método:

realizar una secuenciación aleatoria en al menos una parte de una pluralidad de las moléculas de ácido nucleicocontenidas en la muestra biológica para obtener un número de secuencias predeterminado, en el que lassecuencias representan una fracción del genoma humano;

alinear, con un sistema informatizado, cada secuencia con un genoma humano;

determinar una primera cantidad de secuencias identificadas como alineadas con un primer cromosoma;

determinar una segunda cantidad de secuencias identificadas como alineadas con uno o más segundoscromosomas;

determinar un parámetro a partir de la primera y de la segunda cantidad; en el que el parámetro representa unacantidad relativa entre la primera y la segunda cantidades; y

comparar el parámetro con uno o más valores de límites, para determinar una clasificación de si existe unaaneuploidía cromosómica fetal para el primer cromosoma.

Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal utilizando secuenciación genómica

Campo de la invención La presente invención se refiere, en líneas generales, al ensayo del diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal determinando desequilibrios entre diferentes secuencias de ácidos nucleicos, y más particularmente, a la identificación de trisomía 21 (síndrome de Down) y otras aneuploidías cromosómicas mediante ensayo de una muestra materna (por ejemplo, sangre) .

Antecedentes

La aneuploidía cromosómica fetal es el resultado de la presencia de una o varias dosis anómalas de un cromosoma o región cromosómica. Las dosis anómalas pueden ser anormalmente altas, por ejemplo, presencia de un cromosoma 21 o región cromosómica extra, en la trisomía 21, o anormalmente bajas, por ejemplo, ausencia de una copia del cromosoma X, en el síndrome de Turner.

Los métodos de diagnóstico prenatales convencionales de una aneuploidía cromosómica fetal, por ejemplo, trisomía 21, implican el muestreo de material fetal a través de procedimientos invasivos, tales como amniocentesis o muestreo de vellosidades coriónicas, que constituyen un riesgo finito de pérdida fetal. Para estratificar a las gestantes según el riesgo se han utilizado procedimientos no invasivos tales como exploración por ultrosonido y marcadores bioquímicos, antes de los procedimientos de diagnóstico invasivos definitivos. Sin embargo, estos métodos de exploración miden normalmente fenómenos epigenéticos asociados con aneuploidías cromosómicas,

por ejemplo, trisomía 21, en lugar de anomalías cromosómicas principales, y por tanto tienen una precisión de diagnóstico limitada y otras desventajas, tales como estar muy influenciadas por la edad gestacional.

El descubrimiento en 1977 de ADN fetal libre circulando en el plasma materno ofrece nuevas posibilidades al diagnóstico prenatal no invasivo (Lo, YMD y Chiu, RWK 2007 Nat Rev Genet 8, 71-77) . A pesar de que este método se ha aplicado fácilmente al diagnóstico prenatal de trastornos ligados al sexo (Costa, JM et al. 2002 N Engl J Med 346, 1502) y a determinados trastornos genéticos sencillos (LO, YMD et al. 1998 N Engl J Med 339, 1734-1738) , su aplicación a la detección prenatal de aneuploidías cromosómicas fetales ha sido un reto considerable (Lo, YMD y Chiu, RWK 2007, citado anteriormente) . En primer lugar, los ácidos nucleicos fetales co-existen en el plasma materno con un alto fondo de ácidos nucleicos de origen materno que, con frecuencia, pueden interferir con el

análisis de ácidos nucleicos fetales (Lo, YMD et al. 1998 Am J Hum Genet 62, 768-775) . En segundo lugar, los ácidos nucleicos fetales circulan en el plasma materno predominantemente en una forma libre, dificultando la obtención de información sobre la dosificación de genes o cromosomas dentro del genoma fetal.

Recientemente se han realizado desarrollos significativos que superan estos retos (Benachi, A & Costa, JM 2007 Lancet 369, 440-442) . Una estrategia detecta ácidos nucleicos específicos fetales en el plasma materno, superando así el problema de la interferencia con el fondo materno (Lo, YMD y Chiu, RWK 2007, citado anteriormente) . La dosificación del cromosoma 21 se dedujo a partir de las proporciones de alelos polimórficos en las moléculas de ADN/ARN derivadas de placenta. Sin embargo, este método es menos preciso cuando las muestras contienen menos cantidad de ácido nucleico diana y sólo pueden aplicarse a fetos que son heterocigotos para polimorfismos 45 diana, lo cual es solo un subconjunto de la población si se usa un polimorfismo.

Dhallan et al (Dhallan, R, et al. 2007, citado anteriormente Dhallan, R, et al. 2007 Lancet 369, 474-481) describen una estrategia alternativa de enriquecimiento de la proporción de ADN fetal circulante añadiendo formaldehído al plasma materno. La proporción de secuencias del cromosoma 21 aportadas por el feto en el plasma materno se determinó evaluando la razón de alelos específicos fetales heredados por vía paterna con respecto a alelos específicos no fetales para polimorfismos mononucleotídicos, (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms) en el cromosoma 21. De manera similar, se calcularon las razones SNP para un cromosoma de referencia. Después, se dedujo un desequilibrio del cromosoma fetal 21 detectando una diferencia estadísticamente significativa entre las razones SNP para el cromosoma 21 y las del cromosoma de referencia, en la que el significante se definió utilizando 55 un valor fijo de p º 0, 05. Para garantizar una alta cobertura de la población, se definieron más de 500 SNP por cromosoma. Sin embargo, ha habido controversias con respecto a la eficacia del formaldehído para enriquecer el ADN fetal a una alta proporción (Chung, GTY, et al. 2005 Clin Chem. 51, 655-658) y por tanto la reproducibilidad del método requiere evaluarse adicionalmente. Además, como cada feto y madre sería informativo para un número diferente de SNP para cada cromosoma, el poder del ensayo estadístico para la comparación de razones SNP variaría en cada caso (Lo, YMD y Chiu, RWK. 2007 Lancet 369, 1997) . Además, dado que estas estrategias dependen de la detección de polimorfismos genéticos, se limitan a fetos heterocigotos para estos polimorfismos.

La utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la cuantificación de ADN de un locus de cromosoma 21 y de un locus de referencia en cultivos de amniocitos, obtenidos de fetos con trisomía 21 y euploides, 65 Zimmermann et al (2002 Clin Chem. 48, 362-363) pudo diferenciar los dos grupos de fetos basándose en el aumento de 1, 5 veces en las secuencias de ADN del cromosoma 21 en el primero de ellos. Dado que una diferencia de 2

veces en la concentración del molde de ADN constituye una diferencia de un solo ciclo de umbral (Ct) , la discriminación de una diferencia de 1, 5 veces ha sido el límite de la PCR en tiempo real convencional. Para conseguir grados de discriminación cuantitativa más refinados, se requieren estrategias alternativas.

La PCR digital se ha desarrollado para la detección de la desviación de la razón alélica en muestras de ácidos nucleicos (Chang, HW et al. 2002 J Natl Cancer Inst. 94, 1697-1703) . La PCR digital es una amplificación basada en técnicas de análisis de ácidos nucleicos que requiere la distribución de un espécimen que contenga ácidos nucleicos en una multitud de muestras distintas donde cada muestra contiene un promedio no mayor de aproximadamente una secuencia diana por muestra. Las dianas específicas de ácidos nucleicos se amplifican con cebadores específicos de secuencia para generar amplicones específicos por PCR digital. Los loci de ácidos nucleicos diana y las especies de o un panel de cebadores específicos de secuencia a incluir en las reacciones se determinan o se seleccionan antes del análisis de ácidos nucleicos.

Clínicamente, se ha demostrado que es útil para la detección de pérdida de heterocigosidad (LOH, Lost Of

Heterozygosity) en muestras de ADN tumoral (Zhou, W. et al. 2002 Lancet 359, 219-225) . Para el análisis de resultados de PCR digital, estudios previos han adoptado un ensayo de razón de probabilidad secuencial (SPRT, Sequential Probability Ratio Testing) para clasificar los resultados experimentales ya que sugieren la presencia de LOH en una muestra o no (El Karoui et al. 2006 Star Med 25, 3124 a 3133) .

En métodos utilizados en los estudios previos, la cantidad de datos obtenidos de la PCR digital es muy pequeña. Por lo tanto, la precisión puede verse comprometida debido a la poca cantidad de puntos de datos y de fluctuaciones estadísticas típicas.

Por tanto, es deseable que los ensayos no invasivos tengan una alta sensibilidad y especificidad para minimizar

negativos falsos y positivos falsos, respectivamente. Sin embargo, el ADN fetal está presente a una baja concentración absoluta y representa una pequeña parte de todas las secuencias de ADN en el plasma y suero materno. Por lo tanto, también es deseable tener métodos que permitan la detección no invasiva de aneuploidía cromosómica fetal maximizando la cantidad de información genética que podría deducirse de la cantidad limitada de ácidos nucleicos fetales que existe como una población más pequeña en una muestra biológica que contenga ácidos nucleicos maternos de fondo.

Breve sumario La presente invención proporciona métodos para determinar si existe un desequilibrio (por ejemplo, un desequilibrio cromosómico) en las secuencias de ácidos nucleicos dentro de una muestra biológica obtenida de una gestante. Esta determinación puede realizarse usando un parámetro de una cantidad de una región cromosómica clínicamente relevante en relación con otras... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar el diagnóstico prenatal de una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra biológica obtenida de un sujeto femenino gestante con un feto, en el que la muestra biológica incluye moléculas de ácido 5 nucleico libres de células del sujeto femenino y del feto, comprendiendo el método:

realizar una secuenciación aleatoria en al menos una parte de una pluralidad de las moléculas de ácido nucleico contenidas en la muestra biológica para obtener un número de secuencias predeterminado, en el que las secuencias representan una fracción del genoma humano;

alinear, con un sistema informatizado, cada secuencia con un genoma humano; determinar una primera cantidad de secuencias identificadas como alineadas con un primer cromosoma; determinar una segunda cantidad de secuencias identificadas como alineadas con uno o más segundos cromosomas; determinar un parámetro a partir de la primera y de la segunda cantidad; en el que el parámetro representa una cantidad relativa entre la primera y la segunda cantidades; y comparar el parámetro con uno o más valores de límites, para determinar una clasificación de si existe una aneuploidía cromosómica fetal para el primer cromosoma.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es sangre, plasma, suero, orina o saliva maternos. 20

3. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es fluido de lavado transcervical.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el primer cromosoma es el cromosoma 21, el cromosoma 18, el

cromosoma 13, el cromosoma X o el cromosoma Y. 25

5. El método de la reivindicación 1, en el que el parámetro se determina a partir de una razón de la primera cantidad y la segunda cantidad.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la razón es un recuento fraccional del número de secuencias, un 30 número fraccional de nucleótidos secuenciados o una longitud fraccional de secuencias acumuladas.

7. El método de la reivindicación 5, en el que las secuencias que se alinean con el primer cromosoma se seleccionan por ser menores que un número especificado de pares de bases.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el número especificado de pares de bases es de 300 pb, 200 pb o 100 pb.

9. El método de la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico de la muestra biológica se han enriquecido con secuencias originadas a partir de al menos un cromosoma particular. 40

10. El método de la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico de la muestra biológica se han enriquecido con secuencias menores de 300 pb.

11. El método de la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico de la muestra biológica se han 45 enriquecido con secuencias menores de 200 pb.

12. El método de la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico de la muestra biológica se han amplificado usando una reacción en cadena de la polimerasa.

13. El método de la reivindicación 1, en el que las secuencias obtenidas representan al menos una fracción predeterminada del genoma humano.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la fracción representa al menos el 0, 1 % del genoma humano.

15. El método de la reivindicación 13, en el que la fracción representa al menos el 0, 5 % del genoma humano.

16. El método de la reivindicación 1, en el que al menos uno de los valores de límite es dependiente de la concentración fraccional de ADN fetal en la muestra biológica.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la concentración fraccional de ADN fetal en la muestra biológica se determina mediante una cualquiera o más de una proporción de secuencias de cromosoma Y, un marcador epigenético fetal o usando análisis de polimorfismo mononucleotídico.

18. El método de la reivindicación 1, en el que un valor de límite es un valor de referencia establecido a partir de una 65 o más muestras biológicas normales.

19. El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende:

identificar una cantidad de ADN fetal en la muestra biológica; y calcular el número de secuencias a obtener basándose en una precisión deseada y en la cantidad de ADN fetal 5 en la muestra biológica.

20. Un producto de programa informático que comprende un medio legible por ordenador, en el que hay codificadas una pluralidad de instrucciones para controlar un sistema informático para llevara cabo una operación para realizar un diagnóstico prenatal de una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra biológica obtenida de un sujeto femenino gestante con un feto, incluyendo la muestra biológica moléculas de ácido nucleico libres de células del sujeto femenino y del feto; comprendiendo la operación las etapas de:

recibir al menos un número predeterminado de secuencias a partir de una secuenciación aleatoria de al menos una parte de una pluralidad de las moléculas de ácido nucleico incluidas en la muestra biológica y en el que las secuencias representan una fracción del genoma humano; alinear cada secuencia con un genoma humano; determinar una primera cantidad de secuencias identificadas como alineadas con un primer cromosoma; determinar una segunda cantidad de secuencias identificadas como alineadas con uno o más segundos cromosomas;

determinar un parámetro a partir de la primera cantidad y de la segunda cantidad; en el que el parámetro representa una cantidad relativa entre la primera cantidad y la segunda cantidad; comparar el parámetro con uno o más valores de límite y; basándose en la comparación, determinar una clasificación de si existe una aneuploidía cromosómica fetal para el primer cromosoma.

21. El método de la reivindicación 1 que adicionalmente comprende: calcular el número de moléculas de ácido nucleico a secuenciar basándose en una precisión deseada.

22. El método de la reivindicación 21, en el que la precisión deseada es de al menos el 95 %. 30

23. El método de la reivindicación 1, en el que la primera cantidad y la segunda cantidad se determinan a partir de secuencias identificadas por alinearse únicamente con el primer cromosoma y uno o más segundos cromosomas respectivamente.

24. El método de la reivindicación 1, en el que el número de secuencias determinado es de al menos 120.000 cuando la muestra biológica tiene un 20 % o más de ADN fetal, de al menos 180.000 cuando la muestra biológica tiene un 10 % o más de ADN fetal, o de al menos 540.000 cuando la muestra biológica tiene un 5 % o más de ADN fetal.