Detección del virus del papiloma humano (VPH) usando sondas de ácidos nucleicos, microperlas y clasificadores celulares activados por fluorescencia (FACS).

Un conjunto de perlas para detectar una cepa del VPH y/o para diferenciar entre dos o más cepas del VPH,

en el que el conjunto de perlas comprende una pluralidad de subconjuntos de perlas específicos de una cepa del VPH en el que:

(a) las perlas de cada subconjunto son homogéneas con respecto al tamaño;

(b) las perlas dentro de cada subconjunto específico de una cepa del VPH se enlazan químicamente a una sonda de captura de ácido nucleico que es capaz de unirse a una región específica de una cepa del VPH de un genoma del VPH;

(c) cada subconjunto de perlas es distinguible en virtud de diferencias mensurables en el tamaño de la perla, la presencia o ausencia de una marca ópticamente detectable, y la intensidad de marca ópticamente detectable, en el que la marca ópticamente detectable está provista en la sonda de captura en cada perla; y

(d) se mezclan entre sí al menos dos subconjuntos de perlas, con una sonda de captura de ácido nucleico seleccionada de la lista constituida por los SEQ ID NO: 5 a 20, para producir un conjunto de perlas, en el que la identidad del subconjunto y, por lo tanto, la cepa del VPH es identificable por citometría de flujo basándose en el tamaño, la intensidad de marca y la discriminación de secuencias.

Detección del virus del papiloma humano (VPH) usando sondas de ácidos nucleicos, microperlas y clasificadores celulares activados por fluorescencia (FACS)

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de los ensayos de diagnóstico y detección. Más en particular, la presente invención proporciona métodos y reactivos que incluyen biochips para detectar la presencia de, o distinguir entre, uno o más analitos en una muestra.

Descripción de la técnica anterior

Los detalles bibliográficos de la bibliografía proporcionada en la memoria descriptiva objeto se enumeran al final de la memoria descriptiva.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debería considerarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

La necesidad de métodos de examen rápidos y fiables para detectar múltiples analitos en un ensayo individual es vital no sólo en los campos de la diagnosis clínica, sino también para su uso en el examen, por ejemplo, para el examen de toxinas ambientales y de fármacos.

Una de tales áreas que necesita urgentemente métodos y reactivos de examen mejorados es el campo de las enfermedades infecciosas. Por ejemplo, una estimación conservadora del uso mundial de pruebas diagnósticas para enfermedades de transmisión sexual, tales como el virus del papiloma humano (VPH), es aproximadamente de 2.. de pruebas al año.

Muchas de las pruebas existentes para examinar las causas de enfermedades infecciosas requieren mucho tiempo, son laboriosas, caras, a menudo son específicas sólo para un patógeno específico y/o no pueden diferenciar entre diferentes cepas de patógenos.

El VPH es el principal patógeno causante de cáncer de cuello uterino. Sin embargo, el taxón del VPH comprende muchas cepas del patógeno, de las cuales sólo algunas están asociadas con el desarrollo de cáncer de cuello uterino y otros carcinomas. Por consiguiente, las cepas del VPH se clasifican típicamente como cepas de alto riesgo, incluyendo las 13 cepas que representan aproximadamente el 98 % de los casos de cáncer de cuello uterino, o cepas de bajo riesgo que no están asociadas típicamente con el desarrollo de cáncer de cuello uterino.

Actualmente, el cáncer de cuello uterino se detecta mediante un frotis de Papanicolau. En esta técnica, se recogen células del cuello uterino mediante raspado o lavado. Estas células se colocan después sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio para producir el frotis. Después, un patólogo examina el portaobjetos, buscando células aberrantes. El frotis de Papanicolau, sin embargo, es un ensayo algo insatisfactorio para determinar inequívocamente el riesgo de cáncer de cuello uterino, ya que la técnica tiene una tasa de falsos negativos de aproximadamente el 2 % y la técnica no puede distinguir un taxón de alto riesgo y de bajo riesgo.

Los documentos KR 2483674 y WO 354149 enseñan métodos para analizar el genotipo del VPH basándose en perlas microesféricas LabMAP, donde las sondas se acoplan a las perlas y las perlas se identifican basándose únicamente en fluorescencia.

El documento WO 2/4698 desvela análisis múltiplex de factores solubles mediante citometría de flujo en los cuales micropartículas de activación y micropartículas de detección forman complejos con factores solubles y los complejos se detectan y cuantifican.

El documento WO 24/185 desvela portadores de ácidos nucleicos sólidos o semisólidos codificados para uso en la multiplexación de reacciones basadas en ácidos nucleicos de fase sólida, y un método para identificar una molécula de ácido nucleico que tiene una característica definida dentro de una población de dos o más moléculas de ácido nucleico diferentes.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un ensayo de detección que puede detectar un analito en una muestra y/o diferenciar un número de analitos diferentes. Además, los reactivos y métodos de la presente invención descritos en este documento son relativamente rápidos y económicos comparados con algunos ensayos de detección existentes.

Sumario de la invención

A lo largo de toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que vienen a continuación, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra comprender, y variaciones tales como comprende y que comprende, se entenderá que implican la inclusión de un número entero o etapa o un grupo de números enteros o etapas establecidos pero no la exclusión de algún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Se hace referencia a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos mediante un número identificador de secuencia (SEQ ID NO:). Los SEQ ID NO: corresponden numéricamente a los identificadores de secuencia <4>1 (SEO ID NO:1), <4>2 (SEQ ID NO:2), etc. En la tabla 1 se proporciona un resumen de los identificadores de secuencia. Después de las reivindicaciones se proporciona un listado de secuencias.

La presente invención proporciona ensayos que permiten la detección de uno o más analitos y/o que diferencian entre miembros dentro de una clase de analitos. En particular, se emplea análisis de multiplexación basado en las propiedades de los analitos y de los componentes del ensayo para identificar o distinguir entre analitos.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un conjunto de perlas para detectar uno o más analitos y/o para diferenciar entre dos o más miembros dentro de una clase de analitos, en el que el conjunto de perlas comprende una pluralidad de subcojuntos de perlas en los que:

(a) las perlas de cada subconjunto son homogéneas con respecto al tamaño;

(b) las perlas dentro de cada subconjunto se acoplan a un reactante que reaccionará específicamente con un analito de interés dado en una muestra que se va a probar;

(c) el reactante en cada perla se marca con la misma marca con cada subconjunto de perlas que tienen una intensidad fluorescente diferente para crear una mezcla heterogénea de subconjuntos de perlas basándose en la intensidad fluorescente; y

(d) se mezclan entre sí al menos dos subconjuntos de perlas para producir un conjunto de perlas, en el que la identidad del subconjunto y, por lo tanto, el reactante al que se ha acoplado la perla es identificable por citometría de flujo basándose en el tamaño, la intensidad fluorescente y la discriminación de analitos.

En otro aspecto, la presente invención contempla un método para detectar y/o diferenciar entre dos o más analitos en una muestra, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con un conjunto de perlas específico para los analitos de interés;

(b) incubar dicho conjunto de perlas con dicha muestra durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que dicho(s) analito(s) en dicha muestra reaccione(n) específicamente con un reactante en una perla dentro de dicho conjunto de perlas; y

(c) detectar y/o diferenciar los analitos en la muestra que se unen a un reactante en dicha perla.

En un aspecto relacionado, los reactantes se pueden marcar con uno o más fluorocromos que además permiten la diferenciación entre miembros dentro de una clase de analitos. En un aspecto preferido, la presente invención proporciona métodos y conjuntos de perlas que pueden detectar y/o distinguir entre analitos dentro de una muestra biológica, en los que los analitos son específicos para un patógeno infeccioso.

Las muestras biológicas contempladas en este documento incluyen sangre, suero, saliva, heces, orina, fluido tisular, semen, exudado, pus, fluido respiratorio y mucosidad y empapadores procedentes de llagas, cánceres y lesiones tópicas.

El término patógeno se refiere a un microorganismo o virus que infecta o coloniza una muestra. Los patógenos ejemplares incluyen virus, bacterias, hongos y microorganismos eucariotas. Un virus incluye un lentivirus (por ejemplo, el virus del SIDA, HIV-I, HIV-II, HTLV-IV), retrovirus y el virus de la gripe aviar. En una realización preferida, patógeno incluye un microorganismo o virus que infecta a un organismo multicelular tal como un animal o una planta. Por consiguiente, en una realización, el analito puede considerarse como un patógeno de animal o planta. Sin embargo, la presente invención engloba la detección y/o diferenciación de entidades no patogénicas que colonizan organismos multicelulares tales como simbiontes, endófitos, colonizadores gastrointestinales y similares. Los métodos de la presente invención también son aplicables a la... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de perlas para detectar una cepa del VPH y/o para diferenciar entre dos o más cepas del VPH, en el que el conjunto de perlas comprende una pluralidad de subconjuntos de perlas específicos de una cepa del VPH en

el que:

(a) las perlas de cada subconjunto son homogéneas con respecto al tamaño;

(b) las perlas dentro de cada subconjunto específico de una cepa del VPH se enlazan químicamente a una sonda de captura de ácido nucleico que es capaz de unirse a una región específica de una cepa del VPH de un genoma del

VPH;

(c) cada subconjunto de perlas es distinguible en virtud de diferencias mensurables en el tamaño de la perla, la presencia o ausencia de una marca ópticamente detectable, y la intensidad de marca ópticamente detectable, en el que la marca ópticamente detectable está provista en la sonda de captura en cada perla; y

(d) se mezclan entre sí al menos dos subconjuntos de perlas, con una sonda de captura de ácido nucleico seleccionada de la lista constituida por los SEQ ID NO: 5 a 2, para producir un conjunto de perlas, en el que la identidad del subconjunto y, por lo tanto, la cepa del VPH es identificable por citometría de flujo basándose en el tamaño, la intensidad de marca y la discriminación de secuencias.

2. El conjunto de perlas de la reivindicación 1, en el que las sondas marcadas y no marcadas se mezclan en diferentes proporciones y se conjugan con las perlas.

3. El conjunto de perlas de la reivindicación 1 ó 2, en el que la cepa del VPH se selecciona de las cepas 6, 11, 16,

18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 66 y 68.

4. El conjunto de perlas de la reivindicación 3, en el que la cepa del VPH se selecciona de la 6, 11,31 y 33.

5. El conjunto de perlas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende 16 subconjuntos de perlas específicos de una cepa del VPH, cada uno con una sonda de captura de ácido nucleico seleccionada de la lista constituida por los SEQ ID NO: 5 a 2.

6. El conjunto de perlas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los tamaños de perla se seleccionan del grupo constituido por 3, pm, 3,5 pm, 4,1 pm, 5, pm, 5,6 pm y 6,8 pm.

7. El conjunto de perlas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las perlas se marcan con un fluorocromo seleccionado del grupo constituido por hidroxicumarina, aminocumarina, metoxicumarina, azul cascada, amarillo Lucifer, NBD, ficoeritrina (PE), PerCP, aloficocianina, Hoechst 33342, DAP1, azul SYTOX, Hoechst 33258, cromomicina A3, mitramicina, YOYO-1, verde SYTOX, naranja SYTOX, 7-AAD, naranja de acridina, TOTO-1, To- PRO-1, naranja de tiazol, TOTO-3, TO-PRO-3, LDS 751, colorantes Alexa Fluor incluyendo Alexa Fluro-35, -43, - 488, - 532, -546, -555, -556, -594, -633, -647, -66, -68, -7 y -75; colorantes BoDipy, incluyendo BoDipy 63/65 y BoDipy 65/665; colorantes CY, en particular Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy 5.5 y Cy7; 6-FAM (fluoresceína); PE-Cy5, PE-Cy7, fluoresceína dT; hexaclorofluoresceína (Hex); 6-carboxi-4', 5'-dicloro-2', 7'-dimetoxifluoresceína (JOE); colorantes Oregon Green, incluyendo 488-X y 514; colorantes de rodamina, incluyendo X-rodamina, lisamina rodamina B, verde de rodamina, rojo de rodamina y ROX; TRITC, tetrametilrodamina (TMR); carboxitetrametilrodamina (TAMRA); tetraclorofluoresceína (TET); Rojo 6B, FluorX, BODIPY-FL, colorante SYBR Green I, y Texas Red.

8. Un método para preparar el conjunto de perlas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el método seleccionar una pluralidad de subconjuntos de perlas tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, por medio del cual se mezclan entre sí al menos dos subconjuntos de perlas para producir un conjunto de perlas, en el que la identidad del subconjunto y, por lo tanto, la cepa del VPH es identificable por citometría de flujo basándose en el tamaño, la intensidad de marca y la discriminación de secuencias.

9. Un método para diagnosticar una infección por VPH en un sujeto humano, comprendiendo dicho método:

(i) aislar el ácido nucleico de una muestra procedente del sujeto humano que comprende supuestamente el VPH;

(ii) amplificar el ácido nucleico de dicha muestra usando cebadores que generan un amplicón que es distinto para dicho analito o una cepa particular de dicho analito;

(iii) amplificar opcionalmente una secuencia de ácido nucleico de control del ADN genómico del sujeto humano;

(iv) efectuar el marcado del(los) amplicón(es) enumerado(s) en las etapas (ii) y/o (iii);

(v) hibridar el(los) amplicón(es) marcado(s) a un conjunto de perlas tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

(vi) determinar a cuál de los reactantes se ha unido un amplicón; en el que la asociación de un amplicón con un 5 reactante particular es indicativa de una infección por VPH en el sujeto humano.

1. Uso del conjunto de perlas se una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de un agente de diagnóstico para diagnosticar el VPH y/o diferenciar entre dos o más cepas del VPH.

11. Un método para detectar y/o diferenciar entre una o más cepas particulares del VPH en una muestra biológica,

comprendiendo dicho método las etapas de:

(i) aislar el ácido nucleico de la muestra biológica procedente del sujeto humano que comprende supuestamente el VPH;

(ii) amplificar el ácido nucleico de dicha muestra usando cebadores que generan un amplicón que es distinto para cada cepa del VPH;

(iii) amplificar opcionalmente una secuencia de ácido nucleico de control;

(iv) efectuar el marcado del(los) amplicón(es) enumerado(s) en las etapas (ii) y/o (iii);

(v) hibridar el(los) amplicón(es) marcado(s) a un conjunto de perlas tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

(vi) determinar a cuál de los reactantes se ha unido un amplicón;

en el que la asociación de un amplicón con un reactante particular es indicativa de la presencia de una cepa particular del VPH en la muestra.