Biosensor que usa modos de galería susurrante en microesferas.

Un método para la detección de un analito, comprendiendo dicho método poner en contacto un conjunto de partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende dicho analito,

en el que cada partícula de dicho conjunto de partículas microesferoidales comprende un compañero de unión inmovilizado de dicho analito, y en el que el conjunto de partículas tiene un perfil de modo de galería susurrante (WGM) definido, en el que la unión de dicho analito a dicho compañero de unión inmovilizado da como resultado un cambio en dicho perfil de WGM indicado por un desplazamiento espectral en uno o más picos del perfil de WGM de dicho conjunto de partículas microesferoidales, lo que es indicativo de la presencia de dicho analito, y la detección de la unión entre dicho analito y el compañero de unión mediante la detección de dicho desplazamiento espectral en uno o más picos de dicho perfil de WGM,

caracterizado por que cada partícula de dicho conjunto de partículas microesferoidales comprende un punto cuántico como marcador ópticamente detectable, y la emisión desde dicho marcador ópticamente detectable establece dicho perfil de WGM.

Biosensor que usa modos de galería susurrante en microesferas Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente al campo de la detección de analitos. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de cambios en los perfiles del modo de galería susurrante (WGM) de partículas microesferoidales inducidos por la unión de un analito a un compañero de unión inmovilizado en la partícula, para detectar así la presencia del analito. La presente invención también se refiere a protocolos de multiplexado y a los analitos detectados mediante los cambios en el perfil del WGM.

Descripción de la técnica anterior Los detalles bibliográficos de las referencias proporcionadas en la actual memoria descriptiva están recogidos al final de la memoria descriptiva.

Los rápidos avances en la Genómica y la Proteómica han destacado las carencias de los métodos tradicionales de trabajo intensivo para examinar y detectar la interacción entre dos moléculas. Existe una necesidad de diseñar métodos extremadamente sensibles para el análisis de la interacción entre moléculas diferentes y la detección de analitos en una muestra. El desarrollo de métodos que permitan dicho análisis sin la necesidad de marcar uno u otro, o ambos analitos y/o los compañeros de unión de los mismos, sería particularmente deseable.

Actualmente los chips génicos proporcionan un medio de análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento mediante el uso de matrices de oligonucleótidos inmovilizadas sobre portaobjetos. Sin embargo, esta tecnología depende del marcaje de al menos una de las moléculas.

Los intentos de desarrollar métodos y dispositivos para el examen de la interacción de moléculas que no dependan del marcaje de una o más de las moléculas incluyen biosensores, que son los usados con más frecuencia para el análisis de ADN y/o de proteínas basado en métodos ópticos. Véase, por ejemplo, Baird y Myszka, J Mol Recognit

14: 261 -268, 2001, Rich y Myszka, J Mol Recognit 15: 352 -376, 2002, Li et al. Science 299: 840 -843, 2003 y Lin et al. Science 278: 840 -843, 1997 que describen métodos ópticos que incluyen dispositivos interferométricos. Malmqvist, Nature 361: 186 -187, 1993 desvela sensores de resonancia de plasmón superficial (SPR) . La SPR detecta un límite de < 10 pg·mm-2 de carga de masa (Karlsson y Stahlberg, Anal Biochem 228: 274 -280, 1995) y permite la detección en tiempo real de interacciones biomoleculares. Sin embargo, la SPR requiere una instrumentación cara y específica y la capacidad de mediciones múltiples está limitada.

La presente invención proporciona reactivos y métodos para, entre otros, la detección de interacciones entre analitos y sus compañeros de unión sin la necesidad del marcaje de ninguna molécula.

El documento WO 02/13337 y el documento US 2002/0172457 divulgan métodos para la detección de un analito en una muestra, que comprenden poner en contacto un conjunto de microesferas con la muestra, en el que cada microesfera comprende un compañero de unión inmovilizado de dicho analito y tiene un perfil de modo de galería susurrante definido, e iluminar dicha muestra, en el que la unión del analito al compañero de unión provoca un desplazamiento espectral en uno o más picos del perfil de WGM de la luz de iluminación transmitida.

El documento US 6.583.399 desvela un sensor de resonancia basado en óptica útil para la detección y la discriminación de sustancias específicas presentes en el entorno, en el que el resonador óptico puede comprender microesferas.

R. E. Benner et al, "Observation of Structure Resonances in the Fluorescence Spectra from Microspheres", Physical Review Letters, volumen 44, número 7, páginas 475 -478, describen la excitación interna de un perfil de modo de galería susurrante en una microesfera de poliestireno impregnada con un colorante fluorescente.

Sumario de la invención La presente invención proporciona métodos y reactivos para, entre otros, la detección de moléculas en una muestra. Estas moléculas se denominan en el presente documento analitos. La presencia o la estructura de los analitos no necesita ser conocida, y por lo tanto el método en cuestión es ideal para la detección de compañeros de unión desconocidos hasta la fecha de receptores huérfanos y de potenciales moduladores de la expresión de ácidos nucleicos o de proteínas, incluyendo actividad enzimática, plegamiento, antigenicidad o función. Los métodos de la presente invención se basan en parte en el fenómeno de que los marcadores ópticamente detectables incluidos en o sobre una partícula mostrarán un perfil de modo de galería susurrante (WGM) característico. La referencia a "ópticamente detectable" incluye la referencia a la detección mediante un medio espectrométrico. Cuando un analito

objetivo interactúa con un compañero de unión inmovilizado sobre la partícula microesferoidal, el perfil de WGM cambia, permitiendo una detección muy sensible incluso de acontecimientos de unión raros.

El WGM sólo permite la emisión de ciertas longitudes de onda desde la partícula. El resultado de este fenómeno es que las habituales amplias bandas de emisión (de 10 -100 nm de ancho) de, por ejemplo, un fluoróforo, se contraen y aparecen como una serie de picos afilados correspondientes efectivamente a los patrones de luz de modo vertical dentro de la partícula. De acuerdo con la presente invención, se ha determinado que el perfil de WGM es extremadamente sensible a los cambios en la superficie de la partícula microesferoidal y que el perfil de WGM se modifica cuando la partícula microesferoidal interactúa con los analitos o con las moléculas de su entorno.

La invención se refiere a un método para la detección de un analito según se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho método poner en contacto un conjunto de partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende dicho analito, en el que cada partícula del conjunto de partículas microesferoidales comprende un compañero de unión inmovilizado de dicho analito y en el que el conjunto de partículas tiene un perfil de modo de galería susurrante (WGM) definido, en el que la unión de dicho analito a dicho compañero de unión inmovilizado da como resultado un cambio en dicho perfil de WGM indicado por un desplazamiento espectral en uno o más picos del perfil de WGM de dicho conjunto de partículas microesferoidales, que es indicativo de la presencia de dicho analito, y la detección de la unión de dicho analito y del compañero de unión mediante la detección de dicho desplazamiento espectral de uno o más picos de dicho perfil de WGM, en el que cada partícula de dicho conjunto de partículas microesferoidales comprende un punto cuántico en forma de un marcador detectable ópticamente, y la emisión procedente de dicho marcador detectable ópticamente establece dicho perfil de WGM.

Los métodos de la presente invención pueden ser aplicados para detectar la modulación del perfil de WGM de una partícula microesferoidal en el que dicha modulación es el resultado de la detección de la unión o de otra asociación de moléculas en una muestra a potenciales partículas de unión inmovilizadas en la superficie de la partícula microesferoidal. La detección de las reacciones de unión entre un analito y su compañero de unión basada en cambios apreciables en los perfiles de WGM permite la identificación y el aislamiento de los analitos.

Una característica de la presente invención es que las partículas microesferoidales pueden ser excitadas con una amplia variedad de fuentes luminosas, facilitando la medición en muchos perfiles diferentes de WGM.

La partícula microesferoidal puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido, por ejemplo, un soporte sólido puede incluir un portaobjetos de microscopio.

En una forma de realización específica, la presente invención proporciona una partícula microesferoidal que comprende una partícula de látex o de sílice que tiene entre 1 µm y 100 µm de diámetro, marcada con un punto cuántico, comprendiendo adicionalmente la partícula un supuesto compañero de unión de un analito que se va a detectar. El marcador detectable ópticamente es detectable a las longitudes de onda del visible, y la partícula microesferoidal muestra a uno o más perfiles de WGM. Uno o más de los perfiles de WGM de la partícula microesferoidal modula de forma detectable cuando los analitos interactúan con el compañero de unión inmovilizado en la partícula. Cualquiera de dichos cambios en el perfil de WGM es indicativo de la presencia de un analito que se ha unido a su compañero de unión.

Algunos ejemplos de analitos... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de un analito, comprendiendo dicho método poner en contacto un conjunto de partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende dicho analito, en el que cada partícula 5 de dicho conjunto de partículas microesferoidales comprende un compañero de unión inmovilizado de dicho analito, y en el que el conjunto de partículas tiene un perfil de modo de galería susurrante (WGM) definido, en el que la unión de dicho analito a dicho compañero de unión inmovilizado da como resultado un cambio en dicho perfil de WGM indicado por un desplazamiento espectral en uno o más picos del perfil de WGM de dicho conjunto de partículas microesferoidales, lo que es indicativo de la presencia de dicho analito, y la detección de la unión entre dicho analito y el compañero de unión mediante la detección de dicho desplazamiento espectral en uno o más picos de dicho perfil de WGM, caracterizado por que cada partícula de dicho conjunto de partículas microesferoidales comprende un punto cuántico como marcador ópticamente detectable, y la emisión desde dicho marcador ópticamente detectable establece dicho perfil de WGM.

2. El método de la reivindicación 1 en el que dicha partícula microesferoidal comprende un material seleccionado de la lista que consiste en: sílice, látex, titania, dióxido de estaño, ytria, alúmina, otros óxidos metálicos binarios, perovskitas y otros óxidos metálicos piezoeléctricos, sacarosa, agarosa y otros polímeros.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha partícula comprende sílice.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dichas partículas son esféricas.

5. El método de la reivindicación 1 en el que dicho marcador ópticamente detectable es detectable en uno cualquiera

o más de los intervalos de longitudes de onda del ultravioleta, del visible, del infrarrojo cercano (NIR) y/o del infrarrojo (IR) .

6. El método de la reivindicación 5 en el que dicho marcador ópticamente detectable es detectable en el intervalo de longitudes de onda del visible. 30

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho compañero de unión inmovilizado comprende una molécula de ácido nucleico.

8. El método de la reivindicación 7 en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende ADN. 35

9. El método de la reivindicación 7 en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende ARN.

10. El método de la reivindicación 1, en el que dicho compañero de unión inmovilizado comprende un péptido, un

polipéptido o una proteína. 40

11. El método de la reivindicación 10, en el que dicho péptido, polipéptido o proteína es una enzima.

12. El método de la reivindicación 10, en el que dicho péptido, polipéptido o proteína es un anticuerpo.

13. El método de la reivindicación 1, en el que dicho compañero de unión inmovilizado comprende una molécula de un carbohidrato.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicho carbohidrato es una molécula de un glucosaminoglucano.

15. El método de la reivindicación 1 en el que la modulación de dicho perfil del WGM comprende un desplazamiento hacia el rojo de uno o más picos de dicho perfil.

16. El método de la reivindicación 1 en el que la modulación de dicho perfil del WGM comprende un desplazamiento hacia el azul de uno o más picos de dicho perfil. 55

17. El método de la reivindicación 15 o 16 en el que el desplazamiento hacia el rojo o el desplazamiento hacia el azul comprende un cambio en la longitud de onda de dicho pico o picos de entre 1 y 100 nm.

18. El método de la reivindicación 17 en el que el desplazamiento hacia el rojo o el desplazamiento hacia el azul 60 comprende un cambio en la longitud de onda de dicho pico o picos de entre 1 y 20 nm.