Ensayo de detección de analito.

Un método para la detección de un analito de ácido nucleico en una solución acuosa,

que comprende las etapas de:

(i) anclar una multiplicidad de ligandos de ácidos nucleicos al analito de ácido nucleico a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehído que están marcadas con un fluoróforo o que comprenden un punto cuántico;

(ii) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento inicial;

(iii) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende el analito de ácido nucleico durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el analito de ácido nucleico y su respectivo ligando;

y

(iv) someter las partículas microesferoidales a un medio de detección mediante modos de galería de murmullos (WGM) para la detección de un acontecimiento de unión.

Ensayo de detección de analito Campo

La presente invención se refiere al campo de la detección de analitos: más particularmente, la presente Invención se refiere a la detección de analitos rápida y sensible con biosensores mediante el uso de un ensayo basado en el modo de galería de murmullos (WGM).

Antecedentes

Los detalles biográficos de las publicaciones mencionadas por el autor en esta memoria descriptiva se recogen alfabéticamente al final de la descripción.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debería Interpretarse como, un reconocimiento ni cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general habitual en cualquier país.

Los modos ópticos circulares de los resonadores monolíticos se denominan "modos de galería de murmullos" (WGM) o "resonancias dependientes de la morfología" (MDR). Dichos modos o resonancias son trayectorias cerradas de luz (ondas luminosas verticales) apoyadas por las reflexiones internas totales procedentes de los bordes de un resonador. Un WGM se produce cuando las ondas luminosas verticales de un perfil de emisión en particular están confinadas por una reflexión Interna casi total en el interior de la superficie de una cavidad esférica dieléctrica (Moller ef a/, Applied Physlcs Letters 83 (13): 2686 - 2688, 2003).

La tecnología de WGM se describe con detalle en la Publicación de Patente Internacional N° WO 2005/116615. La tecnología de WGM se basa, en parte, en el fenómeno de que los fluoróforos permiten la generación de un perfil distintivo de WGM. Los fluoróforos están incorporados en puntos cuánticos que son Incorporados en las mlcropartículas por difusión o pueden ser Incorporados durante su elaboración. El tipo de fluoróforo no está limitado, y puede ser, por ejemplo, un colorante orgánico, un lumóforo basado en tierras raras, un nanocristal semiconductor de diversas morfologías y composiciones, un material de fósforo u otro material que emite la luz cuando es iluminado. Después se une este fluoróforo o una mezcla del mismo a las partículas microesferoidales. Cuando un analito objetivo ¡nteractúa con un compañero de unión inmovilizado en la partícula microesferoidal, se modifica el perfil de WGM, permitiendo la detección del acontecimiento de unión.

El WGM sólo permite la emisión de ciertas longitudes de onda a partir de la partícula. El resultado de este fenómeno es que en las habituales amplias bandas de emisión (10 -100 nm de ancho) de, por ejemplo, un fluoróforo, quedan constreñidas y aparecen como una serie de picos afilados correspondientes efectivamente a los patrones de luz de modo vertical dentro de la partícula. El perfil de WGM es extremadamente sensible a los cambios en la superficie de la partícula microesferoidal y el perfil de WGM se modifica cuando la partícula microesferoidal ¡nteractúa con los analitos o con las moléculas de su entorno.

La detección de analitos raros en muestras de origen diverso requiere un medio de detección sensible, versátil y práctico. Existe una necesidad de idear métodos para aumentar la sensibilidad, la versatilidad y la practicidad del WGM para la detección de analitos.

Nuhuji ef a/. (Small 2007, vol. 3, no. 8, páginas 1408 - 1414) divulgan el uso de microesferas de sílice funcionalizadas en la detección basada en WGM de analitos de ácidos nucleicos.

Sumario

La presente invención proporciona un método sensible y reactivos basados en ensayos de detección con el modo de galería de murmullos (WGM) para la detección de analitos de ácidos nucleicos en un medio acuoso.

En particular, la aspiración de la presente invención es describir un método mediante el cual los analitos de ácidos nucleicos no marcados pueden ser detectados rutinariamente en un medio acuoso mediante la explotación de las sensibilidades de los WGM en el entorno. La referencia a un medio tal como un líquido y un gas incluye soluciones acuosas y tampones biológicos, y aire.

El método y los reactivos de la presente invención se basan, por un lado, en la inesperada determinación de que el recubrimiento de microesferas con un fluoróforo per se, por oposición a mediante el uso de puntos cuánticos individuales, mejora la sensibilidad de la detección basada en el WGM. Por otro lado, la selección de una partícula, tal como una partícula con grupos químicos funcionalizados en su superficie, aumenta cuando se produce el recubrimiento tanto con puntos cuánticos como con un fluoróforo directo. Aún por otro lado, la partícula se elige con

un índice de refracción mayor con respecto al medio en el que se lleva a cabo el ensayo. En una forma de realización, la partícula microesferoidal tiene un índice de refracción mayor de 1,40.

Consecuentemente, la presente invención concierne a un método de detección de un anallto de ácido nucleico en una solución acuosa, método que comprende someter microesferas de melamina formaldehído recubiertas con un fluoróforo y una multiplicidad de ligandos de ácidos nucleicos a un medio de detección de WGM para la identificación de un acontecimiento de unión entre los ligandos y el analito que se une al ligando, en el que las microesferas tienen un índice de refracción mayor que el medio que comprende el analito. En una forma de realización, la partícula microesferoidal tiene un índice de refracción mayor de 1,40.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención comprende un método para la detección de un analito en una solución acuosa, que comprende las etapas de:

(i) anclar una multiplicidad de ligandos de ácidos nucleicos al analito de ácido nucleico a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehído que están marcadas con un fluoróforo o que comprenden un punto cuántico;

(¡i) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento inicial;

(iii) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende el analito de ácido nucleico durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el analito de ácido nucleico y su respectivo ligando; y

(¡v) someter las partículas microesferoidales a un medio de detección de modos de galería de murmullos (WGM) para la detección de un acontecimiento de unión.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para la detección de un acontecimiento de unión entre un analito de ácido nucleico y un ligando de ácido nucleico en una solución acuosa, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos de ácidos nucleicos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehído marcadas con un fluoróforo o marcadas con un punto cuántico; (¡i) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento inicial; (i¡¡) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende el analito de ácido nucleico durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el analito de ácido nucleico y su respectivo ligando; y (¡v) someter las partículas microesferoidales a un medio de detección de WGM para la detección de un acontecimiento de unión.

Los ligandos anclados a las partículas microesferoidales son moléculas de ácidos nucleicos y los analitos que se van a detectar pueden ser moléculas de ácidos nucleicos complementarios.

En otra forma de realización, el ligando de ácido nucleico y/o el analito es una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN monocatenario.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un método que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos de ácidos nucleicos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehído marcadas con un fluoróforo o marcadas con un punto cuántico, en una solución acuosa (¡i) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento inicial; (i¡¡) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende el analito durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el analito de ácido nucleico y su respectivo ligando; y (¡v) someter las partículas microesferoidales a un medio de detección de WGM en la elaboración de un ensayo para la detección de un acontecimiento de unión entre un analito de ácido nucleico y un ligando de ácido nucleico.

En una forma... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de un anallto de ácido nucleico en una solución acuosa, que comprende las etapas de:

(I) anclar una multiplicidad de llgandos de ácidos nucleicos al anallto de ácido nucleico a una población de partículas mlcroesferoldales de melamlna formaldehído que están marcadas con un fluoróforo o que comprenden un punto cuántico;

(¡I) poner en contacto las partículas mlcroesferoldales con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento Inicial;

(¡II) poner en contacto las partículas mlcroesferoldales con una muestra que supuestamente comprende el anallto de ácido nucleico durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el anallto de ácido nucleico y su respectivo ligando;

y

(¡v) someter las partículas mlcroesferoldales a un medio de detección mediante modos de galería de murmullos (WGM) para la detección de un acontecimiento de unión.

2. El método de la Reivindicación 1 en el que la partícula mlcroesferoldal tiene un índice de refracción mayor de 1,40.

3. El método de la Reivindicación 1 o 2 en el que la solución acuosa es un tampón o un fluido biológico.

4. El método de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en el que el anallto de ácido nucleico y/o el ligando de ácido nucleico comprende ADN monocatenarlo.

5. El método de la Reivindicación 4 en el que el ADN monocatenarlo se prepara mediante la digestión de un ADN blcatenarlo con endonucleasas de restricción y/o una exonucleasa.

6. El método de la Reivindicación 5 en el que las endonucleasas de restricción son endonucleasas de restricción de Tipo 1.

7. El método de la Reivindicación 5 en el que la exonucleasa es la exonucleasa Lambda.

8. El método de la Reivindicación 4 en el que el ADN monocatenarlo se prepara a partir de una molécula híbrida de ARN:ADN.

9. El método de la Reivindicación 8 en el que la molécula híbrida de ARN:ADN comprende un ADN hibridado con un ARN mensajero preparado mediante transcripción Inversa.

10. El método de la Reivindicación 9 en el que el ARN es ARN vírico.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que el analito o el ligando deriva de una muestra aislada obtenida a partir de una fuente biológica, industrial, de laboratorio o medioambiental.

12. El método de la Reivindicación 11 en el que la muestra comprende material de origen mineral, sintético, eucarlota, procariota o vírico.

13. El método de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12 en el que las partículas microesferoidales están marcadas con un punto cuántico.

14. Uso de un método que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos de ácidos nucleicos a analltos de ácidos nucleicos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehído marcadas con un fluoróforo o marcadas con un punto cuántico en una solución acuosa (¡i) poner en contacto las partículas mlcroesferoldales con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento inicial; (i¡¡) poner en contacto las partículas microesferoidales con una muestra que supuestamente comprende el analito durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el analito y su respectivo ligando; y (¡v) someter las partículas microesferoidales a un medio de detección de WGM en la elaboración de un ensayo para la detección de un acontecimiento de unión entre un analito de ácido nucleico y un ligando de ácido nucleico.

15. Un método para la detección de un acontecimiento de unión entre un analito de ácido nucleico y un ligando de ácido nucleico en una solución acuosa, que comprende las etapas de: (i) anclar una multiplicidad de ligandos a una población de partículas microesferoidales de melamina formaldehído marcadas con un fluoróforo o marcadas con un punto cuántico; (¡i) poner en contacto las partículas microesferoidales de melamina formaldehído con una muestra de control negativo y determinar un espectro del momento inicial; (i¡¡) poner en contacto las partículas microesferoidales de melamina formaldehído con una muestra que supuestamente comprende el analito durante un

tiempo y en unas condiciones suficientes para facilitar un acontecimiento de unión entre el analito y su respectivo ligando; y (iv) someter las partículas microesferoidales de melamina formaldehído a un medio de detección de WGM para la detección de un acontecimiento de unión.