Derivados de anticuerpos recombinantes, de cadena sencilla, trivalentes triespecíficos o biespecíficos.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido consiste en:

(a) un primer dominio de inmunoglobulina que consiste en un dominio VL unido a un dominio VH, en el que el dominio de inmunoglobulina se une específicamente a un antígeno expresado en células tumorales;

(b) un segundo dominio de inmunoglobulina que consiste en un dominio VL unido a un dominio VH, en el que el dominio de inmunoglobulina se une específicamente a un antígeno expresado en células tumorales; y

(c) un tercer dominio de inmunoglobulina que consiste en un dominio VL ligado a un dominio VH, en el que el dominio de inmunoglobulina se une específicamente a un antígeno de célula efectora, en el que la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en células NK, células T, granulocitos neutrófilos, monocitos y macrófagos, en el que al menos uno de los antígenos expresado en células tumorales unido por el dominio de inmunoglobulina de (a) o (b) es un antígeno expresado en células madre tumorales y/o en células precursoras o progenitoras tumorales; y

(d) opcionalmente, al menos un (poli)péptido no relacionado con los dominios de inmunoglobulina;

y en el que la molécula de ácido nucleico codifica al menos un enlazador que separa al menos un dominio VH de uno VL o al menos un dominio VL de uno VH.

La presente invención se refiere una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere además a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, un huésped no humano transformado con el vector de la invención, un procedimiento para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula hospedadora de la invención en condiciones adecuadas y aislar el polipéptido producido y un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención o producido por el procedimiento de la invención. Además, la presente invención se refiere a composiciones para diagnóstico y farmacéuticas y procedimientos para tratar tumores.

En la presente memoria descriptiva, se citan varios documentos. El contenido de la divulgación de estos documentos incluyendo los manuales de los fabricantes se incorpora en su totalidad por referencia.

Las leucemias son cánceres de la sangre o de la médula ósea y se caracterizan por una proliferación anómala de células sanguíneas, habitualmente leucocitos. La leucemia se divide clínica y patológicamente en sus formas aguda y crónica. La leucemia aguda se caracteriza por la proliferación rápida de células sanguíneas inmaduras. Este alto número de células inmaduras hace a la médula ósea incapaz de producir células sanguíneas sanas. Las formas agudas de leucemia pueden producirse en niños y jóvenes adultos. Se requiere tratamiento inmediato en leucemias agudas debido a la rápida progresión y acumulación de las células malignas, que después se vierten al torrente sanguíneo y se propagan a otros órganos del cuerpo. La leucemia crónica se distingue por la acumulación excesiva de células sanguíneas relativamente maduras, pero aún anómalas. Típicamente tarda de meses a años en progresar, las células se producen a una velocidad mucho mayor que las células normales, dando como resultado muchos glóbulos blancos anómalos en la sangre. La leucemia crónica se produce principalmente en personas mayores, pero puede teóricamente producirse en cualquier grupo de edad. Mientras que la leucemia aguda debe tratarse inmediatamente, las formas crónicas se controlan en ocasiones durante algún tiempo antes del tratamiento para asegurar la eficacia máxima de la terapia. Las enfermedades se clasifican además de acuerdo con el tipo de célula anómala que se halle mayoritariamente en la sangre (células linfoides frente a células mieloides) dando como resultado cuatro categorías principales de leucemia: leucemia linfocítica aguda (también conocida como Leucemia Linfoblástica Aguda, o ALL), Leucemia Linfoide Crónica (CLL), Leucemia Mielógena Aguda (también conocida como Leucemia Mieloide Aguda o AML) y Leucemia Mielógena Crónica (CML).

La terapia aplicada habitualmente de enfermedades cancerosas que se originan en el sistema hematopoyético incluye irradiación y/o quimioterapia. Además, en ciertas circunstancias, la posibilidad adicional de trasplante de médula ósea se considera adecuada. Sin embargo, estas terapias son más o menos tóxicas para el paciente y la mayoría de las veces, no conducen a la cura completa de la enfermedad. Recientemente, una inmunoterapia basada en anticuerpos monoclonales ha entrado en la fase clínica y se ha demostrado ya que es eficaz. Ejemplos prominentes son el Rituximab (anti-CD2) para el tratamiento de ciertos linfomas no-Hodgkin de linfocitos B (NHL) y Campath 1H (anti-CD52) en el tratamiento de ciertas leucemias linfáticas crónicas (Reff et al., 1994; Onrust et al., 1999; Riechmann et al., 1988; Hale et al., 1988). También se ha demostrado que este enfoque es exitoso en enfermedades tales como diferentes tipos de hemoblastosis y también en tumores sólidos. Otros anticuerpos están en un estado clínico avanzado, por ejemplo Epratuzumab (anti-CD22) para NHL (Carnahan et al., 23; Leonard et al., 23).

Una alternativa a esos anticuerpos son anticuerpos unidos a isótopos radiactivos. Son ejemplos de estos anticuerpos BEXXAR (anti CD2-I131) y ZEVALIN (anti CD2-Y9) (Kaminski et al., 1993; Davis et al., 27; Cheung et al.\ 26). En lugar de radioisótopos, pueden usarse otras sustancias tales como toxinas, tal como se realiza para la inmunotoxina Mylotarg (anti CD33 acoplado con la toxina caliqueamicina; Hamann et al., 22; Sievers et al., 1999).

La ventaja general de los anticuerpos en el tratamiento de enfermedades cancerosas es su mayor especificidad por células cancerosas en comparación con células sanas. En particular en el caso de enfermedades hematológicas, las células tumorales son fácilmente accesibles debido a su presencia en la sangre, médula ósea o tejidos menos compactos.

Los inconvenientes importantes de los anticuerpos en el uso anterior son su tamaño que limita su accesibilidad a ciertos tejidos o su capacidad para penetrar en tumores. Además, las interacciones con receptores de Fe de células no citotóxicas (por ejemplo linfocitos B o plaquetas) o con receptores inhibidores tales como FcyRIIIb alteran su efecto terapéutico (Peipp y Valerius, 22; Clynes et al., 2). Además, los polimorfismos bi-alélicos pueden reducir la sensibilidad a una terapia de anticuerpo, lo que se demostró, por ejemplo, para Rituximab (Cartron et al., 22; Weng y Levy, 23).

Aunque la relevancia clínica de la citotoxicidad dependiente del complemento aún sigue sin estar clara (Weng y Levy 21), el reclutamiento de células efectoras inmunitarias y la inducción de ADCC por implicación de receptores de Fe (FcR) desempeña un papel importante in vitro e in vivo, como se ha demostrado para Rituximab (Cartron, et al 22, Weng y Levy 23). Por lo tanto, la potenciación de la actividad ADCC puede representar un enfoque prometedor para mejorar la terapia basada en anticuerpos (Ab). En consecuencia, se han usado varios enfoques diferentes para potenciar las funciones mediadas por células efectoras de diferentes anticuerpos monoclonales

(mAb), por ejemplo, mejora de la unión de la parte Fe con los FcR por glico-ingeniería o mediante introducción de sustituciones de aminoácidos (Barbin, ef al 26, Lazar, et al 26).

Se ha conseguido una mejora significativa adicional de las funciones efectoras mediante la generación de anticuerpos biespecíficos (bsAb), que en algunos casos produjeron citotoxicidad in vltro aún más fuerte que los mAb parentales (Weiner, et al 1993) y fueron capaces de superar algunas de las limitaciones de los anticuerpos convencionales (Peipp y Valerius, 22). Dos sitios de unión, uno para un antígeno expresado en células tumorales y otro para una molécula desencadenante en la superficie de células efectoras inmunes (por ejemplo células T, células NK, monocitos, macrófagos o granulocitos) conducen al reclutamiento eficaz de estas células efectoras a las células tumorales y a destrucción específica de las células tumorales mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o fagocitosis. Típicamente, la lisis de células tumorales se induce por unión del anticuerpo con moléculas desencadenantes citotóxicas tales como CD2, CD28 o CD3 (expresadas en células T), CD16 (FcyRIIIa, expresada en células NK), CD64 (FcyRI; expresada en neutrófilos activados y monocitos/macrófagos) o CD89 (FcaRI, expresada en neutrófilos; Peipp y Valerius, 22). Se sabe que los células NK están entre los primeros en regenerarse después de trasplantes con células madre, lo que los hace particularmente adecuados para eliminar las células de la enfermedad mínima residual (MRD) (Eyrich et al., 21; Lang et al., 23).

En comparación con técnicas utilizadas previamente, la disponibilidad de anticuerpos recombinantes facilita en gran medida la producción y purificación de anticuerpos biespecíficos. Son conocidos habitualmente formatos de anticuerpos tales como los diacuerpos, minicuerpos, diacuerpos de cadena sencilla o fragmentos variables de cadena sencilla biespecíficos en tándem (bsscFv) (Peipp y Valerius, 22), de los cuales los dos últimos consisten en solamente una molécula.

El antígeno o los antígenos elegido(s) para unirse con el derivado de anticuerpo terapéutico es/son cruciales para la terapia. Se han descrito anteriormente anticuerpos que se unen a CD19 expresado en linfocitos B en el tratamiento de neoplasias linfoides B (Grossbard et al., 1992). CD19 se expresa en linfocitos B en todos los estadios de su desarrollo excepto para la célula plasmática madura. Hasta ahora, este antígeno no se ha encontrado en células madre hematopoyéticas u otras células más allá del compartimento linfoide B. Los formatos usados hasta la fecha comprendían anticuerpos completos, inmunoconjugados, inmunoliposomas, inmunotoxinas y formatos biespecíficos. El tratamiento de seis pacientes... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un pollpéptldo, en el que el polipéptido consiste en:

(a) un primer dominio de inmunoglobulina que consiste en un dominio VL unido a un dominio VH, en el que el dominio de inmunoglobulina se une específicamente a un antígeno expresado en células tumorales;

(b) un segundo dominio de inmunoglobulina que consiste en un dominio VL unido a un dominio VH, en el que el dominio de inmunoglobulina se une específicamente a un antígeno expresado en células tumorales; y

(c) un tercer dominio de inmunoglobulina que consiste en un dominio VL ligado a un dominio VH, en el que el dominio de inmunoglobulina se une específicamente a un antígeno de célula efectora, en el que la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en células NK, células T, granulocitos neutrófilos, monocitos y macrófagos, en el que al menos uno de los antígenos expresado en células tumorales unido por el dominio de inmunoglobulina de (a) o (b) es un antígeno expresado en células madre tumorales y/o en células precursoras o progenitoras tumorales; y

(d) opcionalmente, al menos un (poli)péptido no relacionado con los dominios de inmunoglobulina;

y en el que la molécula de ácido nucleico codifica al menos un enlazador que separa al menos un dominio Vh de uno V|_ o al menos un dominio V|_ de uno Vh.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que los dominios de inmunoglobulina de los elementos

(a) y (b) se unen al mismo antígeno expresado en células tumorales.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que los dominios de inmunoglobulina de los artículos

(a) y (b) se unen a diferentes antígenos expresados en células tumorales.

4. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el al menos un antígeno expresado en células madre tumorales o en células precursoras o progenitoras tumorales es CD19, CD33, CD13, CD44var, CD123, CD96 o CLL-1.

5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los antígenos expresados en células tumorales y unidos mediante los dominios Inmunoglobulina de (a) y (b) son CD19 y CD33, CD19 y CD13, CD19 y CD123, CD19 y CD44var, CD19 y MCSP, CD33 y CD13, CD33 y CD123, CD33 y CD44var, CD33 y CD96, CD33 y CLL-1, CD13 y CD123, CD13 y CD44var, CD13 y CD96, CD13 y CLL-1, CD123 y CD44var, CD123 y CD96, CD123 y CLL-1, CD44var y CD96, CD44var y CLL-1, o CD96 y CLL-1.

6. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el antígeno de célula efectora unido mediante el dominio de inmunoglobulina de (c) es CD16 (FcyRIIIa), CD64 (FcyRI), NKG2D, NKp3, NKp44, NKp46, CD28, CD2 o CD3.

7. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que al menos un dominio de inmunoglobulina comprende al menos un resto de cisteína capaz de formar enlaces disulfuro intramoleculares.

8. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el enlazador es un enlazador peptídico de al menos 5 aminoácidos.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que los enlazadores son de longitud uniforme si está presente más de un enlazador.

1. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que los enlazadores son de diferente longitud si está presente más de un enlazador.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 9, en el que las secuencias de aminoácidos de los enlazadores son idénticas.

12. El ácido nucleico de la reivindicación 9, en el que las secuencias de aminoácidos de los enlazadores son diferentes.

13. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que codifica dos dominios de inmunoglobulina que se unen específicamente a CD19 y un dominio de inmunoglobulina que se une específicamente a CD16 (FcyRIIIa).

14. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que codifica dos dominios de inmunoglobulina que se unen específicamente a CD33 y un dominio de inmunoglobulina que se une específicamente a CD16 (FcyRIIIa).

15. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que el (poli)péptido no relacionado con dominios de

inmunoglobulina es una etiqueta Strep, una etiqueta His, una etiqueta Myc, una etiqueta Flag, una secuencia líder de secreción kappa, albúmina de suero de humano (hsa) o fragmentos de la misma, péptidos capaces de unirse a hsa o a otras proteínas del suero; un péptido capaz de unirse con el receptor de Fe neonatal (FcRn), aldolasa de músculo humano (hma) o un fragmento de la misma, región bisagra de CD8, Interleucina 2, Interleucina 15, Interleucina 18, Factor Estimulante de Colonias de Macrófagos y Granulocitos (GM-CSF), Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos (G-CSF) o un péptido que proporciona al menos un sitio de N-glicosilación.

16. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que las células tumorales son células de leucemia.

17. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que las células madre tumorales son células madre leucémicas.

18. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que las células precursoras o progenitoras tumorales son células precursoras o progenitoras leucémicas.

19. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que el tumor es una leucemia o un linfoma.

2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

21. Un hospedador no humano transformado con el vector de la reivindicación 2.

22. El hospedador no humano de la reivindicación 21, en el que el hospedador es una célula.

23. Un método para la producción de un polipéptido que comprende el cultivo de la célula hospedadora de la reivindicación 22 en condiciones adecuadas y el aislamiento del polipéptido recombinante producido.

24. Un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o producido por el método de la reivindicación 23.

25. Una composición de diagnóstico que comprende al menos uno de

(a) la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19

(b) el vector de la reivindicación 2 o

(c) el polipéptido de la reivindicación 24.

26. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19

(b) el vector de la reivindicación 2 o

(c) el polipéptido de la reivindicación 24.

27. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, el vector de la reivindicación 2 o el polipéptido de la reivindicación 24 para uso en el tratamiento de tumores.

28. La molécula de ácido nucleico o el vector o el polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el tumor es una leucemia o linfoma.

29. La molécula de ácido nucleico o el vector o el polipéptido para uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la leucemia es AML, CML, ALL, CLL o linfoma no Hodgkin.