Conjugados preparados con proteínas libres de agregados.

Una urato oxidasa purificada (uricasa), que contiene formas tetraméricas y octaméricas purificadas de la uricasa,

que se puede preparar por eliminación de los agregados mayores que octámeros detectables por dispersión de la luz.

Conjugados preparados con proteínas libres de agregados Declaración de los Derechos del Gobierno en la Invención Una parte de la investigación descrita en esta solicitud se hizo con el apoyo de la U.S. Israel Binational Industrial Research and Development Foundation. De acuerdo con esto, el Gobierno de EEUU puede tener determinados derechos en la invención.

Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La presente invención se refiere a la purificación y modificación química de proteínas para prolongar sus vidas medias circulantes y reducir su inmunogenicidad. Más específicamente, la invención se refiere a la eliminación de agregados mayores que octámeros de urato oxidasas (uricasas) antes de la conjugación con poli (etilen glicoles) o poli (etilen óxidos) . Esto elimina sustancialmente la inmunogenicidad de la uricasa sin comprometer su actividad uricolítica.

Descripción de la Técnica Relacionada Las declaraciones contenidas en esta sección de antecedentes no constituyen una admisión de la técnica anterior, en lugar de esto reflejan los comentarios subjetivos de los propios inventores sobre el estado de la técnica y las interpretaciones del estado de la técnica en el momento en el que se hizo la invención. Estas interpretaciones pueden incluir la visión personal, no descrita hasta este momento, de los inventores, cuyas visiones no eran parte en sí mismas de la técnica anterior.

Las urato oxidasas (uricasas; E.C. 1.7.3.3) son enzimas que catalizan la oxidación del ácido úrico a un producto más soluble, alantoína, un metabolito de purina que se excreta más fácilmente. Los seres humanos no producen uricasa enzimáticamente activa, como resultado de varias mutaciones en el gen de la uricasa adquiridas durante la evolución de los primates superiores. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84. Consecuentemente, en individuos susceptibles, concentraciones excesivas de ácido úrico en la sangre (hiperuricemia) y en la orina (hiperuricosuria) pueden dar lugar a artritis dolorosa (gota) , depósitos de urato desfigurantes (tofos) y fallo renal. En algunos individuos afectados, los fármacos disponibles tales como allopurinol (un inhibidor de la síntesis del ácido úrico) producen efectos adversos que limitan el tratamiento o no alivian estas condiciones adecuadamente. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Farn, AG, (1990) BailliÃre´s Clin Rheumatol 4:177-192. Las inyecciones de uricasa pueden disminuir la hiperuricemia y la hiperuricosuria, al menos temporalmente. Como la uricasa es una proteína extraña para los seres humanos, sin embargo, incluso la primera inyección de la proteína no modificada de Aspergillus flavus indujo reacciones anafilácticas en un cierto porcentaje de pacientes tratados (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816) , y las respuestas inmunológicas limitan su utilidad para el tratamiento crónico o intermitente. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Méd 10:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554.

La Solicitud de Patente de EEUU No. de Serie 09/370.084 y la Solicitud Internacional publicada No. PCT/US99/17514, describen poli (etilen glicol) -urato oxidasa (PEG-uricasa) que retiene al menos aproximadamente 75% de la actividad uricolítica de la uricasa no conjugada y tiene una inmunogenicidad sustancialmente reducida. En dicha uricasa purificada, cada subunidad está unida covalentemente a una media de 2 a 10 cadenas de PEG, en la que cada molécula de PEG puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 5 kDa y 100 kDa.

Se sabe que la agregación de proteínas incrementa su inmunogenicidad. Este conocimiento ha contribuido al desarrollo de métodos para agregar proteínas intencionadamente por tratamientos tales como desnaturalización térmica y entrecruzamiento por exposición a glutaraldehído antes de usarse en la preparación de vacunas o para la inmunización de animales para producir antisueros.

También se ha admitido que la agregación no intencionada de proteínas contribuye a la inmunización o sensibilización durante el uso clínico de proteínas terapéuticas, p. ej. para la gamma globulina humana (Henney et al. (1988) N. Engl. J. Med. 278:2244-2248) y para la hormona del crecimiento humana (Moore et al. (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:691-697) . La contribución de los agregados a la inmunogenicidad del interferón alfa humano se ha demostrado en ratones BALB/c (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1472-1478) y se ha desarrollado un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para su medida (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1394-1400) .

En contraste con los efectos conocidos de la agregación en la inmunogenicidad de proteínas, no hay publicaciones del efecto de la agregación en la inmunogenicidad de proteínas conjugadas con poli (alquilen glicoles) tales como PEG. Existe una necesidad de conjugados de poli (alquilen glicol) -uricasa que eliminen sustancialmente la inmunogenicidad de la uricasa sin comprometer su actividad uricolítica. La presente invención proporciona dichas composiciones.

WO 00/07629 describe conjugados peg-urato.

Caliceti et al. 1999, Bioconjugate Chem, 10: 638-646 describe propiedades de uricasa conjugada con polímeros neutros y anfifílicos.

Tsuji et al. 1985, Int. J. Immunopharmacology, 7 (5) : 725-730 describe estudios sobre la antigenicidad de la uricasa modificada con polietilen glicol (PEG) .

Yasuda et al. 1990, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (JP) , 38 (7) : 2053-2056 describen propiedades de conjugados macromoleculares de uricasa con dextrano y polietilen glicol.

Compendio de la Invención La conjugación de proteínas con poli (alquilen glicoles) , especialmente PEG, produce conjugados con una inmunogenicidad reducida y una persistencia incrementada en la corriente sanguínea. En un intento de producir conjugados de uricasa sustancialmente no inmunogénicos que retienen sustancialmente toda la actividad uricolítica de la preparación de uricasa no modificada, se descubrió que trazas de agregados grandes de uricasa en el material de partida eran sorprendentemente eficaces para provocar tanto la formación de anticuerpos como el aclaramiento acelerado de la circulación, siendo ambos perjudiciales, después de inyecciones repetidas de los conjugados con PEG preparados a partir de uricasa que contiene dichos agregados. Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que la inmunogenicidad incrementada y el aclaramiento acelerado no eran debidos a la presencia de agregados bien definidos, de tamaño moderado de la subunidad de la uricasa que son mayores que el tetrámero nativo, p. ej. agregados que contienen ocho subunidades (octámeros) . La forma octamérica de la uricasa está presente en concentraciones suficientemente altas en la mayoría de las preparaciones de uricasa como para ser detectable por su absorbancia de luz UV, p. ej. a 214 nm ó 276 nm, o por su contribución al índice de refracción u otras medidas de la concentración de proteínas. No obstante, se encontró que los octámeros en sí mismos contribuyen mínimamente a la inmunogenicidad y aclaramiento acelerado de los conjugados PEG-uricasa, en contraste con las cantidades mucho menores de los agregados mucho mayores que no son detectables por absorbancia de UV en las condiciones ensayadas pero que se detectan fácilmente por dispersión de la luz estática (Raleigh) o dinámica. Por lo tanto, se encontró que la eliminación de dichas trazas de agregados muy grandes antes de la conjugación con PEG disminuía la inmunogenicidad y el aclaramiento acelerado de los conjugados PEGuricasa resultantes en un grado sorprendente.

La presente invención se define por las reivindicaciones.

La memoria describe urato oxidasa (uricasa) purificada sustancialmente libre de agregados mayores que octámeros. Preferiblemente, la uricasa es una uricasa de mamíferos. Más preferiblemente, la uricasa es uricasa de hígado porcino, hígado bovino o hígado ovino. En un aspecto de esta realización preferida, la uricasa es recombinante. En otro aspecto de esta realización preferida, la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de uricasa de hígado porcino, bovino, ovino o de babuino. Ventajosamente, la uricasa es quimérica. Preferiblemente, la uricasa es uricasa PKS. En otro aspecto de esta realización preferida, la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de la uricasa de hígado de babuino en la que la tirosina 97 se ha reemplazado por histidina. Preferiblemente, la uricasa comprende un extremo amino terminal y un extremo carboxi terminal, y en la que la uricasa está truncada en un extremo o ambos extremos. Ventajosamente, la uricasa es una uricasa fúngica o microbiana. Preferiblemente, la uricasa fúngica o microbiana se aísla de Aspergillus... [Seguir leyendo]

1. Una urato oxidasa purificada (uricasa) , que contiene formas tetraméricas y octaméricas purificadas de la uricasa, que se puede preparar por eliminación de los agregados mayores que octámeros detectables por dispersión de la luz.

2. La uricasa de la reivindicación 1, que es una uricasa de mamíferos.

3. La uricasa de la reivindicación 2, que es uricasa de hígado porcino, de hígado bovino o de hígado ovino.

4. La uricasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es recombinante.

5. La uricasa de la reivindicación 4, que es quimérica.

6. La uricasa de la reivindicación 4 o reivindicación 5, que comprende partes de la secuencia de uricasa de hígado porcino, bovino, ovino o de babuino.

7. La uricasa de la reivindicación 4 o reivindicación 5, que comprende partes de la secuencia de uricasa de hígado porcino e hígado de babuino.

8. La uricasa de la reivindicación 6, que es uricasa porcina en la que el resto de arginina 291 de SEQ ID NO:1 se ha reemplazado por lisina (R291 K) y el resto de treonina 301 de SEQ ID NO:1 se ha reemplazado por serina (T301 S) (uricasa PKS) .

9. La uricasa de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8, que está truncada en el extremo amino, en el extremo carboxilo, o en ambos extremos amino y carboxilo.

10. La uricasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que no contiene más de aproximadamente 2% de agregados mayores que octámeros.

11. Un conjugado que comprende la uricasa purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha uricasa purificada se conjuga con poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) .

12. Una disolución que comprende la uricasa purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la uricasa purificada se conjuga con poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) .

13. El conjugado de la reivindicación 11 o la disolución de la reivindicación 12, en el que dicho poli (etilen glicol) es monometoxi poli (etilen glicol) .

14. El conjugado de la reivindicación 11 o la disolución de la reivindicación 12, en el que dicha uricasa se conjuga con dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) mediante una unión seleccionada del grupo que consiste en uretano (carbamato) , amina secundaria y amida.

15. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-14, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 60 kDa.

16. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-15, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 30 kDa.

17. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-14, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 30 kDa.

18. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-17, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en el que el número medio de cadenas de dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) conjugado con dicha uricasa es aproximadamente 2 a aproximadamente 12 por subunidad de uricasa.

19. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-18, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en el que dicho número medio de cadenas de dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) es aproximadamente 6 a aproximadamente 10 por subunidad de uricasa.

20. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-19, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, en el que dicho número medio de cadenas de dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) es aproximadamente 7 a aproximadamente 9 por subunidad de uricasa.

21. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-20, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-20, en el que dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) es lineal.

22. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11, ó 13-20, o la disolución de una cualquiera de las reivindicaciones 12-20, en el que dicho poli (etilen glicol) o poli (etilen óxido) es ramificado.