Un procedimiento para aumentar la potencia biológica in vitro de un interferón-beta no glucosilado que comprendeacoplar selectivamente,

en presencia de un tensioactivo, uno o más polímeros solubles en agua sintéticos alaminoácido del extremo amino de dicho interferón-beta, en el que dicho aminoácido del extremo amino estálocalizado remotamente del (de los) dominio(s) de unión a receptor de dicho interferón-beta, y en el que(i) el polímero soluble en agua lleva un único grupo aldehído y el acoplamiento comprende alquilación reductorade una base de Schiff formada con el polímero soluble en agua y reducción de la base de Schiff con un agentereductor suave, o

(ii) el acoplamiento comprende acoplar una hidrazida, hidracina, semicarbazida u otro polímero soluble en aguaque contiene amina a un residuo de serina o treonina del extremo N del interferón-beta que ha sido escindidooxidativamente a un aldehído con peryodato, y

en el que el polímero soluble en agua es un polialquilenglicol seleccionado del grupo constituido por poli(etilenglicol),monometoxipoli (etilenglicol) y monohidroxipoli (etinelglicol).

Conjugados de polietilenglicol de interferón-beta-1b con potencia biológica in vitro potenciada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención está en los campos de la bioquímica de proteínas y las ciencias farmacéuticas y médicas. En particular, la invención proporciona procedimientos para la producción de conjugados entre polímeros solubles en agua (por ejemplo, poli (etilenglicol) y derivados del mismo) y citocinas (por ejemplo, interferón-beta) , conjugados que tienen elevada potencia en comparación con conjugados de polímero de la misma citocina sintetizada por procedimientos convencionales. La invención también proporciona conjugados producidos por tales procedimientos, composiciones que comprenden tales conjugados, kits que comprenden tales conjugados y composiciones y procedimientos de uso de los conjugados y composiciones en la prevención, diagnóstico y tratamiento de una variedad de afecciones médicas y veterinarias. La invención también proporciona procedimientos de determinación del (de los) sitio (s) de unión de polímeros por alquilación reductora bajo ciertas condiciones.

Técnica relacionada

La siguiente descripción de la técnica relacionada incluye interpretaciones de los presentes inventores que no están, por sí mismas, en la técnica anterior. Las citocinas son proteínas reguladoras secretadas que controlan la supervivencia, crecimiento, diferenciación y/o función efectora de células de modo endocrino, paracrino o autocrino (revisado en Nicola, N.A. (1994) en: Guidebook to Cytokines and Their Receptors, Nicola, N.A., ed., pág. 1-7, Oxford University Press, Nueva York) . Debido a su potencia, especificidad, pequeño tamaño y facilidad relativa de producción en organismos recombinantes, las citocinas pueden tener posibles aplicaciones como agentes terapéuticos.

Dos factores clave han impedido el desarrollo de citocinas, en particular, y proteínas recombinantes, en general, como agentes terapéuticos – sus semividas generalmente cortas en la circulación y su posible antigenicidad e inmunogenicidad. Como se usa en el presente documento y generalmente en la materia, el término “antigenicidad” se refiere a la capacidad de una molécula para unirse a anticuerpos preexistentes, mientras que el término “inmunogenicidad” se refiere a la capacidad de la molécula para provocar una respuesta inmunitaria in vivo, si esa respuesta implica la formación de anticuerpos (una “respuesta humoral”) o la estimulación de respuestas inmunitarias celulares.

Para la administración de proteínas terapéuticas recombinantes, la administración intravenosa (i.v.) es frecuentemente deseable con el fin de lograr las mayores actividades en circulación y para minimizar problemas de biodisponibilidad y degradación. Sin embargo, las semividas de proteínas pequeñas tras la administración i.v. son normalmente extremadamente cortas (véanse los ejemplos en Mordenti, J. y col., (1991) Pharm Res 8:1351-1359; Kuwabara, T. y col., (1995) Pharm Res 12:1466-1469) . Las proteínas con radios hidrodinámicos que superan los de la albúmina de suero, que tienen un radio de Stokes de aproximadamente 36 Å y un peso molecular de aproximadamente 66.000 Dalton (66 kDa) , son generalmente retenidas en la circulación sanguínea por riñones sanos. Sin embargo, proteínas más pequeñas, que incluyen citocinas tales como factor estimulante de colonias de granulocitos (“G-CSF”) , interleucina-2 (“IL-2”) , interferón-alfa (“IFN-alfa”) e interferón-gamma (“IFN-gamma”) , son rápidamente eliminadas de la circulación sanguínea por filtración glomerular (Brenner, B.M. y col., (1978) Am J Physiol 234:F455-F460; Venkatachalam, M.A. y col., (1978) Circ Res 43:337-347; Wilson, G., (1979) J Gen Physiol 74:495-509; Knauf, M.J. y col., (1988) J Biol Chem 263:15064-15070; Kita, Y. y col., (1990) Drug Des Deliv 6:157167; Rostaing, L. y col., (1998) , J Am Soc Nephrol 9:2344-2348) . Como resultado, el mantenimiento de concentraciones terapéuticamente útiles de proteínas recombinantes pequeñas en la circulación es problemático tras la inyección. Por tanto, normalmente deben administrarse mayores concentraciones de tales proteínas e inyecciones más frecuentes. Las pautas de dosis resultantes aumentan el coste de la terapia, disminuyen la probabilidad del cumplimiento del paciente y aumentan el riesgo de acontecimientos adversos, por ejemplo, reacciones inmunitarias. Tanto las respuestas inmunitarias celulares como humorales pueden reducir las concentraciones en circulación de proteínas recombinantes inyectadas a un grado tal que pueda excluir la administración de una dosis eficaz o pueda conducir a acontecimientos limitantes del tratamiento que incluyen eliminación acelerada, neutralización de la eficacia y anafilaxia (Ragnhammar, P. y col., (1994) Blood 84:4078-4087; Wadhwa, M. y col., (1999) Clin Cancer Res 5:1353-1361; Hjelm Skog, A. L. y col., (2001) Clin Cancer Res 7:11631170; Li, J. y col., (2001) Blood 98:3241-3248; Basser, R.L. y col., (2002) Blood 99:2599-2602; Schellekens, H., (2002) Clin Ther 24:1720-1740) .

La modificación de proteínas recombinantes por la unión covalente de poli (etilenglicol) (“PEG”) se ha investigado exhaustivamente como un medio de tratar las deficiencias tratadas anteriormente (revisado en Sherman,

M.R. y col., (1997) en: Poly (ethylene glycol) : Chemistr y and Biological Applications, Harris, J.M. y col., eds., pág. 155-169, American Chemical Society, Washington, D.C.; Roberts, M.J. y col., (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:459476) . Se ha mostrado que la unión de PEG a proteínas estabiliza las proteínas, mejora su biodisponibilidad y/o reduce su inmunogenicidad in vivo (la unión covalente de PEG a una proteína u otro sustrato se denomina en el presente documento, y se conoce en la técnica, como “PEGilación”) . Además, la PEGilación puede aumentar significativamente el radio hidrodinámico de proteínas. Si una proteína pequeña tal como una citocina se acopla a una única cadena larga de PEG (por ejemplo, que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 18 kDa) , el conjugado resultante tiene un radio hidrodinámico que supera el de la albúmina de suero y su eliminación de la circulación por los glomérulos renales se retarda espectacularmente. Los efectos combinados de PEGilación proteólisis reducida, reconocimiento inmunitario reducido y tasas reducidas de eliminación renal -confieren ventajas sustanciales con respecto a las proteínas PEGiladas como agentes terapéuticos.

Desde los años 70 se han hecho intentos por usar la unión covalente de polímeros para mejorar la seguridad y eficacia de diversas proteínas para uso farmacéutico (véase, por ejemplo, Davis, F.F. y col., la patente de EE.UU. nº 4.179.337) . Algunos ejemplos incluyen el acoplamiento de PEG o poli (óxido de etileno) (“POE”) a adenosina desaminasa (EC 3.5.4.4) para su uso en el tratamiento de enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (Davis, S. y col., (1981) Clin Exp Immunol 46:649-652; Hershfield, M.S. y col., (1987) N Engl J Med 316:589596) , a superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1) para el tratamiento de afecciones inflamatorias (Saifer, M. y col., las patentes de EE.UU. nº 5.006.333 y 5.080.891) y a urato oxidasa (EC 1.7.3.3) para la eliminación de ácido úrico en exceso de la sangre y orina (Kelly, S.J. y col., (2001) J Am Soc Nephrol 12:1001-1009; Williams, L.D. y col., publicación PCT nº WO 00/07629 A3 y la patente de EE.UU. nº 6.576.235; Sherman, M.R. y col., publicación PCT nº WO 01/59078 A2) .

Los POE y PEG son polímeros compuestos por unidades de óxido de etileno covalentemente ligadas. Estos polímeros tienen la siguiente estructura general:

R1- (OCH2CH2) n-R2

en la que R2 puede ser un grupo hidroxilo (o un derivado reactivo del mismo) y R1 puede ser hidrógeno, como en dihidroxi-PEG (“diol de PEG”) , un grupo metilo, como en monometoxi-PEG (“mPEG”) , u otro grupo alquilo inferior, por ejemplo, como en iso-propoxi-PEG o t-butoxi-PEG. El parámetro n en la estructura general de PEG indica el número de unidades de óxido de etileno en el polímero y se denomina en el presente documento y en la materia el “grado de polimerización”. Polímeros de la misma estructura general, en la que R1 es un grupo alquilo C1-7, también se han denominado derivados de oxirano (Yasukohchi, T. y col., patente de EE.UU. nº 6.455.639) . Los PEG y POE pueden ser lineales, ramificados (Fuke,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para aumentar la potencia biológica in vitro de un interferón-beta no glucosilado que comprende acoplar selectivamente, en presencia de un tensioactivo, uno o más polímeros solubles en agua sintéticos al aminoácido del extremo amino de dicho interferón-beta, en el que dicho aminoácido del extremo amino está localizado remotamente del (de los) dominio (s) de unión a receptor de dicho interferón-beta, y en el que

(i) el polímero soluble en agua lleva un único grupo aldehído y el acoplamiento comprende alquilación reductora de una base de Schiff formada con el polímero soluble en agua y reducción de la base de Schiff con un agente reductor suave, o

(ii) el acoplamiento comprende acoplar una hidrazida, hidracina, semicarbazida u otro polímero soluble en agua que contiene amina a un residuo de serina o treonina del extremo N del interferón-beta que ha sido escindido oxidativamente a un aldehído con per y odato, y

en el que el polímero soluble en agua es un polialquilenglicol seleccionado del grupo constituido por poli (etilenglicol) , monometoxipoli (etilenglicol) y monohidroxipoli (etinelglicol) .

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que (i) comprende formar una mezcla del interferón-beta y el polímero soluble en agua a un pH de 5, 6 a 7, 6.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que en (i) el agente reductor suave comprende cianoborohidruro de sodio.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que en (i) el agente reductor suave comprende piridinaborano.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 llevado a cabo de forma que se minimice la oxidación de al menos un residuo de metionina esencial sobre el interferón-beta.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha potencia biológica se mide en un ensayo de cultivo celular que responde a interferón-beta.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho interferón-beta tiene la secuencia de aminoácidos de interferón--1b especificada en SEC ID Nº: 1.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho interferón-beta tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos en SEC ID Nº: 1.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polímero está covalentemente acoplado al grupo alfaamino de dicho aminoácido del extremo amino.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho acoplamiento covalente de dicho polímero con dicho grupo alfa-amino es por un enlace amina secundaria.

11. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho polialquilenglicol es un monometoxipoli (etilenglicol) .

12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho polialquilenglicol es un monohidroxipoli (etilenglicol) .

13. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho polialquilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa, ambos incluidos.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho polialquilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 8 kDa y aproximadamente 14 kDa, ambos incluidos.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho polialquilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 30 kDa, ambos incluidos.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho polialquilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 18 kDa y aproximadamente 22 kDa, ambos incluidos.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho polialquilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa.

18. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho polialquilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el acoplamiento de dicho polímero con dicho interferón-beta en dicho aminoácido del extremo amino imita los efectos de glucosilación o hiperglucosilación beneficiosos de dicho interferón-beta.

20. Un conjugado obtenible por el procedimiento de cualquier reivindicación precedente.

21. Un conjugado según la reivindicación 20 que comprende un interferón-beta no glucosilado covalentemente acoplado en su aminoácido del extremo amino a uno o más polímeros solubles en agua sintéticos, en el que la potencia biológica in vitro de dicho conjugado de interferón-beta aumenta en comparación con el mismo interferónbeta con el que uno o más de los mismos polímeros solubles en agua sintéticos se ha acoplado al azar con residuos de lisina accesibles al disolvente, y en el que el polímero soluble en agua es un polialquilenglicol seleccionado del grupo que consiste en un poli (etilenglicol) , un monometoxipoli (etilenglicol) y un monohidroxipoli (etilenglicol) .

22. El conjugado de la reivindicación 21, en el que la potencia biológica de dicho conjugado se mide en un ensayo de cultivo celular que responde a interferón-beta.

23. El conjugado de la reivindicación 21, en el que dicho interferón-beta tiene la secuencia de aminoácidos de interferón--1b especificada en SEC ID Nº: 1.

24. El conjugado de la reivindicación 23, en el que la potencia biológica in vitro de dicho interferón--1b aumenta a aproximadamente la potencia del interferón--1a que tiene la secuencia de aminoácidos especificada en SEC ID Nº: 2 y que está glucosilado sobre el residuo de asparagina 80.

25. El conjugado de la reivindicación 22, en el que dicho ensayo de cultivo celular sensible a interferón-beta está seleccionado del grupo que consiste en un ensayo antiproliferativo, un ensayo antivírico, un ensayo de transducción de señales y un ensayo de activación génica.

26. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

27. Un kit que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25.

28. Un kit que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 26.

29. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 para su uso en la prevención, diagnóstico o tratamiento de un trastorno físico sensible a interferón-beta en un animal que padece o está predispuesto a dicho trastorno físico.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 26 para su uso en la prevención, diagnóstico o tratamiento de un trastorno físico sensible a interferón-beta en un animal que padece o está predispuesto a dicho trastorno físico.

31. El conjugado de la reivindicación 29, en el que dicho animal es un mamífero.

32. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en la que dicho animal es un mamífero.

33. El conjugado de la reivindicación 31 o la composición farmacéutica de la reivindicación 32, en el que dicho mamífero es un ser humano.

34. El conjugado de la reivindicación 29, en el que dicho trastorno físico sensible a interferón-beta está seleccionado del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno autoinmunitario y un trastorno genético.

35. El conjugado de la reivindicación 34, en el que dicho cáncer está seleccionado del grupo que consiste en un cáncer de mama, un cáncer uterino, un cáncer de ovario, un cáncer de próstata, un cáncer testicular, un cáncer de pulmón, una leucemia, un linfoma, un cáncer de colon, un cáncer gastrointestinal, un cáncer pancreático, un cáncer de vejiga, un cáncer de riñón, un cáncer de hueso, un cáncer neurológico, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de piel, un carcinoma, un sarcoma, un adenoma y un mieloma.

36. El conjugado de la reivindicación 34, en el que dicha enfermedad infecciosa sensible a interferón-beta está seleccionada del grupo que consiste en una hepatitis vírica, una enfermedad producida por un virus cardiotrópico y VIH/SIDA.

37. El conjugado de la reivindicación 34, en el que dicho trastorno neurodegenerativo sensible a interferón-beta es esclerosis múltiple.

38. El conjugado de la reivindicación 37, en el que dicha esclerosis múltiple está seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple recurrente-remitente, progresiva primaria y progresiva secundaria.

39. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en el que dicho trastorno físico sensible a interferón-beta está seleccionado del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno autoinmunitario y un trastorno genético.

40. La composición farmacéutica de la reivindicación 39, en el que dicho cáncer está seleccionado del grupo que consiste en un cáncer de mama, un cáncer uterino, un cáncer de ovario, un cáncer de próstata, un cáncer testicular, un cáncer de pulmón, una leucemia, un linfoma, un cáncer de colon, un cáncer gastrointestinal, un cáncer pancreático, un cáncer de vejiga, un cáncer de riñón, un cáncer de hueso, un cáncer neurológico, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de piel, un carcinoma, un sarcoma, un adenoma y un mieloma.

41. La composición farmacéutica de la reivindicación 39, en la que dicha enfermedad infecciosa sensible a interferón-beta está seleccionada del grupo que consiste en una hepatitis vírica, una enfermedad producida por un virus cardiotrópico y VIH/SIDA.

42. La composición farmacéutica de la reivindicación 39, en la que dicho trastorno neurodegenerativo sensible a interferón-beta es esclerosis múltiple.

43. La composición farmacéutica de la reivindicación 42, en la que dicha esclerosis múltiple está seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple recurrente-remitente, progresiva primaria y progresiva secundaria.

44. Un procedimiento para la escisión oxidativa selectiva de un residuo de serina o treonina del extremo N de una proteína bioactiva sin oxidar residuos de aminoácidos funcionalmente esenciales de dicha proteína bioactiva, que comprende:

a) ajustar la concentración de ión hidrógeno de una disolución de dicha proteína bioactiva a un pH entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8; b) mezclar dicha disolución de proteína bioactiva con aproximadamente 0, 5 a aproximadamente 5 moles de un per y odato por mol de proteína bioactiva; y c) incubar dicha mezcla durante al menos una hora a una temperatura de entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 40ºC.

45. El procedimiento de la reivindicación 44, en el que dicha proteína bioactiva es un interferón-beta.

46. El procedimiento de la reivindicación 45, en el que dicho interferón-beta es interferón--1b que tiene la secuencia de aminoácidos especificada en SEC ID Nº: 1.