Conjugados de polímeros con antigenicidad disminuida, procedimientos de preparación y usos de los mismos.

Composición farmacéutica que comprende un conjugado que comprende uno o varios componentes bioactivos seleccionados del grupo que consiste en un péptido,

una proteína y una glucoproteína covalentemente unida a al menos un polietilenglicol lineal o ramificado, en donde dicho polietilenglicol, si es lineal, tiene un grupo hidroxilo en el extremo que no está unido al componente o componentes bioactivos ("el extremo distal") o, si es ramificado, tiene un grupo hidroxilo en cada extremo distal, y en donde dicho polietilenglicol está unido a un solo componente bioactivo en un solo sitio en el polietilenglicol, y

un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, caracterizado por que

el conjugado está puro al 95% o más, preferiblemente al 98% o más, más preferiblemente al 99% o más, o al 100%, y en donde dicho al menos un polietilenglicol lineal o ramificado tiene una masa molecular de 10 kDa a 30 kDa.

Conjugados de polímeros con antigenicidad disminuida, procedimientos de preparación y usos de los mismos

Antecedentes de la invención

Campo de la invención La presente invención es sobre los campos de la bioquímica de proteínas y de las ciencias farmacéuticas y médicas. En particular, la invención da a conocer procedimientos para producir conjugados entre polímeros hidrosolubles (p. ej., poli (etilenglicol) y derivados del mismo) y componentes bioactivos, en donde dichos conjugados tienen menos antigenicidad e inmunogenia que los conjugados estándares entre componentes bioactivos y polímeros. La invención también da a conocer los conjugados producidos por tales procedimientos, composiciones que comprenden tales conjugados, kits que comprenden tales conjugados y composiciones, y usos de las composiciones para el tratamiento de una serie de afecciones médicas.

Técnica relacionada Dos factores clave han obstaculizado el desarrollo de las proteínas recombinantes como agentes terapéuticos: su semivida en circulación, por lo general breve, y su posible capacidad antigénica e inmunógena. Tal y como se usa en 15 la presente memoria y en general en la técnica, la terminología "antigenicidad" hace referencia a la capacidad que tiene una molécula para fijarse a los anticuerpos ya existentes, mientras que la terminología "inmunogenia" hace referencia a la capacidad para provocar una respuesta inmunitaria in vivo, tanto si la respuesta implica la formación de anticuerpos (una "respuesta humoral") como la estimulación de la respuesta inmunitaria celular. Para la administración de proteínas terapéuticas recombinantes, a menudo es deseable administrarlas por vía intravenosa 20 (i.v.) para conseguir la mayor actividad en circulación y para disminuir al mínimo los problemas de biodisponibilidad y degradación. Sin embargo, la semivida de las proteínas pequeñas después de la administración i.v. suele ser muy breve (véanse los ejemplos en Mordenti, J. et al., (1991) Pharm. Res. 8: 1351-1359; Kuwabara, T. et al., (1995) Pharm. Res. 12: 1466-1469) . Los riñones sanos suelen retener en el torrente circulatorio las proteínas cuyo radio hidrodinámico excede el de la albúmina sérica, que tiene un radio de Stokes en torno a 36 Ã y una masa molecular 25 en torno a 66.000 Da (66 kDa) . Sin embargo, las proteínas más pequeñas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF", por su nombre en inglés) y la ribonucleasa, se eliminan rápidamente del torrente circulatorio por la filtración glomerular (Brenner, B. M. et al. (1978) Am. J. Physiol 234: F455-F460; Venkatachalam, M.

A. et al. (1978) Circ Res. 43: 337-347; Wilson, G. (1979) J. Gen Physiol 74: 495-509) . Como consecuencia, el mantenimiento de una concentración terapéuticamente útil de las proteínas recombinantes pequeñas en el torrente 30 circulatorio resulta problemático después de la administración i.v. Por lo tanto, se debe administrar una concentración más elevada de tales proteínas e inyectarlas con más frecuencia. El elevado ritmo de las dosis incrementa el coste del tratamiento, disminuye la probabilidad de cumplimiento del paciente e incrementa el riesgo de acontecimientos adversos, p. ej., reacciones inmunitarias. Las respuestas inmunitarias humoral y celular pueden reducir la concentración circulante de las proteínas recombinantes inyectadas hasta un nivel que puede imposibilitar la administración de una dosis eficaz o que puede conducir a acontecimientos que limiten el tratamiento, tales como la anafilaxia (Pui, C. H. et al., (2001) J Clin. Oncol. 19: 697-704) .

Las vías alternativas de administración, tales como las inyecciones subcutánea (s.c.) o intramuscular (i.m.) , pueden solventar algunos de estos problemas al proporcionar una liberación más gradual de las proteínas recombinantes al torrente circulatorio. Sin embargo, la biodisponibilidad puede ser realmente baja, lo que pone difícil que se alcance la concentración eficaz en circulación de tales fármacos. Otro problema que puede estar relacionado con la poca biodisponibilidad de los fármacos administrados por vía s.c. o i.m es el incremento de la probabilidad de degradación de la proteína terapéutica en el sitio de la inyección.

La modificación de las proteínas recombinantes mediante la unión covalente de derivados de poli (etilenglicol) ("PEG") ha sido muy investigado como una manera de abordar los defectos explicados más arriba (revisado en 45 Sherman, M. R. et al. (1997) en: Poly (ethylene glycol) : Chemistr y and Biological Applications, Harris, J. M. et al., eds., American Chemical Society, Washington, D.C., págs. 155-169; Roberts, M. J. et al. (2002) Adv Drug Deliv Res 54: 459-476) . La unión de derivados de PEG a las proteínas se ha demostrado que estabiliza las proteínas, mejora su biodisponibilidad y/o reduce su inmunogenia in vivo (la unión covalente de los derivados de PEG a una proteína u otro sustrato se denomina en la presente memoria "PEGilación", y con el mismo nombre se la conoce en la técnica) . 50 Además, la PEGilación puede incrementar significativamente el radio hidrodinámico de las proteínas. Cuando una proteína pequeña, tal como una citocina u hormona polipeptídica, está conjugada a una sola cadena larga de PEG (p. ej., que tiene una masa molecular de al menos 18 kDa) , el conjugado resultante tiene un radio hidrodinámico más grande que el de la seroalbúmina y se retrasa considerablemente su eliminación a través de los glomérulos renales. Los efectos combinados de la PEGilación (reducción de la proteólisis, reducción del reconocimiento inmunitario y 55 reducción de la tasa de eliminación renal) les confieren ventajas sustanciales a las proteínas PEGiladas como agentes terapéuticos.

Desde los años setenta del siglo XX se lleva investigando sobre utilizar la conexión covalente de los polímeros para mejorar la seguridad y la eficacia de diferentes proteínas para el uso farmacéutico (véase, p. ej., la patente de los

EE.UU. nº 4.179.337) . Algunos ejemplos incluyen la conjugación de PEG o de poli (óxido de etileno) (PEO, por su nombre en inglés) a la adenosina desaminasa (EC 3.5.4.4) para su uso en el tratamiento de enfermedades graves de inmunodeficiencia combinada (Davis, S. et al. (1981) Clin. Exp. Immunol. 46: 649-652; Hershfield, M. S. et al. (1987) N Engl. J. Med. 316: 589-596) . Otros ejemplos incluyen la conjugación de PEG a la superóxido dismutasa (EC

1.15.1.1) para el tratamiento de afecciones inflamatorias (Saifer, M. et al., patentes de los EE.UU. nº 5.006.333 y 5.080.891) y a la urato oxidasa (EC 1.7.3.3) para la eliminación del exceso de ácido úrico de la sangre y de la orina (Inada, Y., solicitud de patente japonesa 55-099189; Kelly, S. J. et al. (2001) J. Am Soc Nephrol 12: 10001-10009; Williams, L. D. et al.; publicación PCT de patente internacional WO 00/07629 A3, que corresponde a la patente de los EE.UU. nº 6.576.235; Sherman, M. R. et al., publicación PCT de patente internacional WO 01/59078 A2) .

Los PEO y los PEG son polímeros compuestos de unidades de óxido de etileno unidas covalentemente. Estos polímeros tienen la estructura general siguiente:

R1- (OCH2CH2) n-R2

donde R2 puede ser un grupo hidroxilo (o un derivado reactivo del mismo) y R1 puede ser hidrógeno, como en "PEG diol", un grupo metilo, como en el monometoxiPEG ("mPEG") u otro grupo alquilo inferior, p. ej., como en el iso15 propoxiPEG o en el t-butoxiPEG. El parámetro n de la estructura general del PEG indica el número de unidades de óxido de etileno del polímero y se denomina "grado de polimerización" en la presente memoria y en la técnica. Los PEG y los PEO pueden ser lineales, ramificados (Fuke, I. et al. (1994) J Control Release 30: 27-34) o con forma de estrella (Marrill, E. W. (1993) J. Biomater Sci Polym Ed 5: 1-11) . Los PEG y los PEO son anfipáticos, esto es, son solubles en el agua y en determinados solventes orgánicos, y se pueden adherir a los materiales que contienen lípidos, entre ellos los virus con envoltura y las membranas de las células bacterianas y de animales. Algunos copolímeros alternantes, al azar, o en bloque, de óxido de etileno (OCH2CH2) y óxido de propileno, que tiene la estructura siguiente:

** (Ver fórmula) **

tienen propiedades que son suficientemente parecidas a las del PEG, que se cree que estos copolímeros son un reemplazo adecuado del PEG en determinadas aplicaciones (véanse, p. ej., las patentes de los EE.UU. nº 4.609.546 y 5.283.317) . La terminología "óxidos de polialquileno" y la abreviatura "PAO" tal y como se utilizan en la presente memoria hacen referencia a tales copolímeros así como a copolímeros de PEG o PEO y poli (oxietilen-oximetileno) (patente de los EE.UU. nº ... [Seguir leyendo]

1. Composición farmacéutica que comprende un conjugado que comprende uno o varios componentes bioactivos seleccionados del grupo que consiste en un péptido, una proteína y una glucoproteína covalentemente unida a al menos un polietilenglicol lineal o ramificado, en donde dicho polietilenglicol, si es lineal, tiene un grupo hidroxilo en el extremo que no está unido al componente o componentes bioactivos ("el extremo distal") o, si es ramificado, tiene un grupo hidroxilo en cada extremo distal, y en donde dicho polietilenglicol está unido a un solo componente bioactivo en un solo sitio en el polietilenglicol, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, caracterizado por que el conjugado está puro al 95% o más, preferiblemente al 98% o más, más preferiblemente al 99% o más, o al 100%, 10 y en donde dicho al menos un polietilenglicol lineal o ramificado tiene una masa molecular de 10 kDa a 30 kDa.

2. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho conjugado tiene una antigenicidad reducida o sustancialmente reducida en comparación con un conjugado que comprende el mismo componente o componentes bioactivos unidos al mismo sitio o sitios del componente o componentes bioactivos con el mismo número de polietilenglicoles del mismo tamaño y estructura lineal o ramificada que contiene uno o varios grupos alcoxilo terminales.

3. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la unión de dicho polietilenglicol a dicho componente o componentes bioactivos se lleva a cabo con un reactivo modificado de al menos un polietilenglicol seleccionado del grupo que consiste en dihidroxiPEG lineales ("PEG dioles") , hidroxiPEGmonoacetales e hidroxiPEG-monoácidos.

4. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la unión de dicho polietilenglicol a dicho componente o componentes bioactivos se lleva a cabo con el uso de un hidroxiPEG reactivo modificado que se selecciona del grupo que consiste en un monoaldehído, un monoéster de un monoácido, una monoamina, un monotiol, un monodisulfuro, un carbonato de monobromofenilo, un carbonato de monoclorofenilo, un carbonato de monofluorofenilo, un carbonato de mononitrofenilo, un monocarbonilimidazol, una monohidrazida, un monocarbazato, una monoyodoacetamida, una monomaleimida, un disulfuro de monoortopiridilo, una monooxima, un monofenilglioxal, una monitiazolidina-2-tiona, un monotioéster, una monotriazina y una monovinilsulfona.

5. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polietilenglicol se selecciona del grupo que consiste en un monihidroxiPEG-ácido y un di-hidroxiPEG-ácido, tal como di-hidroxiPEG-lisina.

6. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho polietilenglicol es un derivado 30 reactivo de dicho dihidroxiPEG lineal.

7. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho polietilenglicol es un derivado reactivo de dicho ácido hidroxiPEG-monocarboxílico.

8. Procedimiento para la producción del conjugado comprendido en la composición de acuerdo con la

reivindicación 1, entre un compuesto bioactivo seleccionado del grupo que consiste en un péptido, una proteína y una 35 glucoproteína, y un polietilenglicol activado en sólo un extremo ("un polietilenglicol monoactivado") que comprende:

(a) obtener un polietilenglicol que no contiene ningún grupo terminal que es un grupo alcoxilo unido establemente, en donde dicho polietilenglicol tiene una masa molecular de 10 kDa a 30 kDa;

(b) opcionalmente, antes de la conversión del polietilenglicol de la etapa (a) en un polietilenglicol monofuncionalmente activado, proteger todo excepto uno de los grupos terminales mediante la adición de uno o varios grupos de bloqueo

retirables, en donde el polietilenglicol monofuncionalmente activado utilizado tiene un grupo hidroxilo en su extremo distal, si es lineal, o tiene un grupo hidroxilo en cada extremo distal, si es ramificado;

(c) producir un derivado monofuncionalmente activado de dicho polietilenglicol al hacer reaccionar dicho polietilenglicol con un compuesto o compuestos modificadores en tales condiciones que dicho polietilenglicol se modifica con un único grupo modificador en un extremo que no contiene dicho grupo o grupos de bloqueo retirables, 45 en donde dicho polietilenglicol monofuncionalmente activado contiene menos del 2% (p/p) del polietilenglicol bifuncionalmente activado.

(d) si un grupo bloqueador se añade para proteger el grupo o grupos terminales, tal y como se describe en la etapa (b) anterior, retirar dicho grupo bloqueador, en una o varias etapas, sin retirar el grupo activador unido como se describe en la etapa (c) anterior, para producir un polietilenglicol monofuncionalmente activado en donde el extremo distal o 50 los extremos distales son grupos hidroxilo; y (e) poner en contacto dicho polietilenglicol monofuncionalmente activado con dicho al menos un componente bioactivo, en condiciones tales que favorecen la unión covalente de dicho polietilenglicol monofuncionalmente activado con dicho componente bioactivo, o 29

(f) otra posibilidad sería realizar la etapa (e) antes de realizar la etapa (d) .

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho grupo modificador se selecciona del grupo que consiste en un aldehído y un grupo carboxilo.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho grupo bloqueador se selecciona del grupo 5 que consiste en un grupo tritilo, un grupo ariloxilo y un grupo t-butoxilo.

11. Composición farmacéutica que comprende un conjugado producido o que se puede producir por el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8.

12. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho conjugado tiene una antigenicidad reducida o sustancialmente reducida en comparación con un conjugado que comprende el mismo

componente bioactivo unido en el mismo sitio o sitios del componente bioactivo con el mismo número de moléculas de polietilenglicol del mismo tamaño y estructura lineal o ramificada que contiene un grupo alcoxilo en el extremo distal, si el polietilenglicol es lineal, o que contiene dos o más grupos alcoxilo en los extremos distales, si el polietilenglicol está ramificado.

13. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en donde el péptido, proteína o glucoproteína se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un proteína del suero, una glucoproteína del suero, una proteína de las células de la sangre, una proteína pigmentaria, hemoglobina, una proteína vírica, una hormona peptídica, una hormona proteica, una hormona glucoproteica, una liberina hipotalámica, una citocina, un factor de crecimiento y péptidos y proteínas y glucoproteínas que imitan o funcionan como antagonistas de alguna del grupo anterior.

14. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha proteína sérica se selecciona del grupo que consiste en una albúmina, una inmunoglobulina, un factor de la coagulación de la sangre, y péptidos y proteínas y glucoproteínas que imitan o funcionan como antagonistas de cualquiera de las proteínas anteriores del suero.

15. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el polietilenglicol monofuncionalmente activado que se utiliza en la síntesis de dicho conjugado se selecciona del grupo que consiste en hidroxiPEG-monoaldehído y un éster reactivo de un hidroxiPEGmonoácido.

16. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el polietilenglicol monofuncionalmente activado utilizado en la síntesis se modifica a partir de un dihidroxiPEG lineal.

17. Kit que comprende: la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 11.

18. Composición de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 11, para ser usada en un procedimiento para prevenir, diagnosticar o tratar un trastorno físico en un animal.

19. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso, dicho animal es un mamífero.

20. Composición de acuerdo con la reivindicación 19, en donde en dicho uso, dicho mamífero es un humano.

21. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso, dicho trastorno físico se selecciona

del grupo que consiste en un cáncer, artritis, una enfermedad infecciosa, un trastorno genético, un trastorno neurológico, un trastorno metabólico, un trastorno enzimático, una enfermedad cardiovascular e hipertensión.

22. Composición de acuerdo con la reivindicación 21, en donde en dicho uso, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de mama, un cáncer de útero, un cáncer de ovario, un cáncer de próstata, un cáncer de testículo, un cáncer de pulmón, una leucemia, un linfoma, un cáncer de colon, un cáncer del tubo digestivo, un cáncer de páncreas, un cáncer de vejiga, un cáncer de riñón, un cáncer de huesos, un cáncer neurológico, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de piel y otros carcinomas, sarcomas, adenomas y mielomas.

23. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso, dicha enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad bacteriana, una enfermedad micótica, un enfermedad vírica y una enfermedad parasitaria.

24. Composición de acuerdo con la reivindicación 19, en donde en dicho uso, dicha enfermedad vírica se selecciona del grupo que incluye VIH/sida y hepatitis.

25. Composición de acuerdo con la reivindicación 21, en donde en dicho uso, dicho trastorno genético se selecciona del grupo que consiste en esclerosis lateral amiotrófica, fibrosis quística, enfermedad de Gaucher, hemofilia y otras hemopatías heredables, enfermedad de Pompe y enfermedad de inmunodeficiencia combinada 50 grave ("IDCG") .

26. Composición de acuerdo con la reivindicación 21, en donde en dicho uso, dicho trastorno neurológico se

selecciona del grupo que incluye enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple.

27. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso, dicha administración es parenteral.

28. Composición de acuerdo con la reivindicación 27, en donde en dicho uso, dicha administración parenteral es intravenosa.

29. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso, dicha administración es oral.

30. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso, dicha administración es tópica.

31. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso, dicha administración es por inhalación.

32. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, en donde en dicho uso dicha administración es rectal.

33. Utilización de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 u 11 a 16, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno físico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26.

34. Utilización de acuerdo con la reivindicación 33, definida adicionalmente por las peculiaridades de cualquiera de las reivindicaciones 19, 20, o 27 a 32.