Composiciones y métodos para estabilizar la transtiretina e inhibir el plegamiento anómalo de la transtiretina.

Un método de cribar un compuesto que impide o reduce la disociación de un tetrámero de transtiretina,

comprendiendo dicho método:

poner en contacto un tetrámero de transtiretina con un compuesto candidato; y

determinar si el compuesto candidato aumenta la energía de activación asociada con la disociación del tetrámero de transtiretina, impidiendo o reduciendo de este modo la disociación del tetrámero de transtiretina.

Composiciones y métodos para estabilizar la transtiretina e inhibir el plegamiento anómalo de la transtiretina

La invención se refiere en general al plegamiento anómalo de proteínas. Más particularmente, esta invención proporciona un método de cribado para un compuesto que impide o reduce la disociación de un tetrámero de transtiretina.

La transtiretina (TTR) es una proteína homotetrámera de 55 kDa presente en el suero y en el líquido cefalorraquídeo. La función de la TTR es transportar L-tiroxina (T4) y proteína de unión a holo-retinol (abreviadamente RBP, por la expresión inglesa Retinol Binding Protein). La TTR es una de las mayores de 20 proteínas amiloidogénicas no homologas que pueden transformarse en fibrillas y otros agregados que conducen a una patología morbosa en seres humanos. Estas enfermedades no parecen ser causadas por una pérdida de función debida a la agregación de proteínas. En lugar de ello, la agregación parece producir una disfunción neuronal/celular por un mecanismo que aún no está claro.

En condiciones desnaturalizantes, la disociación del tetrámero de TTR de tipo natural limitante de la velocidad y el rápido plegamiento anómalo de los monómeros facilita el ensamblaje anómalo formando el material amiloide, que produce supuestamente la amiloidosis sistémica senil (ASS). La disociación y plegamiento anómalo de una de las más de ochenta variantes de la TTR da como resultado la polineuropatía amiloide familiar (PAF) y la cardiomiopatía amiloide familiar (CAF).

El tetrámero de TTR tiene dos sitios de unión a T4 simétricos en C2. Se sabe que la unión negativamente cooperativa de T4 estabiliza el tetrámero de TTR e inhibe la formación de fibrillas amiloides. Desafortunadamente, menos del 1% de TTR tiene T4 unida a ella en el suero humano, porque la globulina de unión al tiroides (TBG) tiene una afinidad con un orden de magnitud mayor porT4 en comparación con la TTR. Además, la concentración sérica de T4 es relativamente baja (0,1 pM) en comparación con la de TTR (3,6-7,2 pM).

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la estabilización cinética del estado natural de la transtiretina inhibe el plegamiento anómalo de la proteína. Este descubrimiento es importante debido al papel que juega el plegamiento anómalo de la proteína en una diversidad de procesos morbosos, incluyendo enfermedades amiloides por transtiretina. Al inhibir el plegamiento anómalo de la transtiretina se puede intervenir en dicha enfermedad, mejorar los síntomas y/o en algunos casos, impedir o curar la enfermedad.

El descubrimiento de que la estabilización cinética del estado natural de la transtiretina inhibe eficazmente el plegamiento anómalo permite el desarrollo de composiciones terapéuticas con una especificidad potencialmente elevada y baja toxicidad. De esta manera, aunque en la presente memoria se describen reactivos de biarilo ilustrativos que tienen la capacidad de estabilizar la transtiretina, se pueden diseñar otros reactivos que estabilicen selectivamente la proteína. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, es posible diseñar y preparar bifenilos policlora- dos, análogos del diflunisal, o benzoxazoles que son muy selectivos para unirse a la transtiretina y que estabilizan el estado natural de la transtiretina.

En un aspecto, la invención se caracteriza por un método de cribado para un compuesto que impida o reduzca la disociación de un tetrámero de transtiretina. El método incluye las siguientes etapas: poner en contacto un tetrámero de transtiretina con un compuesto candidato; y determinar si el compuesto candidato aumenta la energía de activación asociada con la disociación del tetrámero de transtiretina, con lo cual impide o reduce la disociación del tetrámero de transtiretina. El método puede incluir opcionalmente una etapa adicional para medir la capacidad del compuesto candidato para inhibir la formación de fibrillas.

En una realización, el método incluye una etapa para determinar si el compuesto impide la disociación del tetrámero de transtiretina desestabilizando el estado de transición de disociación del tetrámero de transtiretina. En otra realización, el método incluye una etapa para determinar si el compuesto impide la disociación del tetrámero de transtiretina por estabilización del tetrámero de transtiretina más que el estado de transición disociativo.

El compuesto candidato usado en dicho método puede ser opcionalmente una molécula pequeña. Dicha molécula pequeña puede estabilizar el estado natural de la transtiretina a través de la unión al tetrámero, ralentizando de esta manera la disociación y la amiloidosis en condiciones desnaturalizantes y fisiológicas por un mecanismo de estabilización cinética. El compuesto presenta opcionalmente una estequiometría de unión a TTR que excede de 0,1 en sangre humana cuando se administra a una concentración de 10,6 pM.

Una molécula pequeña puede tener opcionalmente un peso molecular menor de 1500 y unirse a la transtiretina positivamente de forma cooperativa o no e impartir una energía de unión > 2,3 kcal/mol. La molécula pequeña puede presentar valores de Kdi y Kd2 < 100 nM (por ejemplo < 10 nM) y/o una elevada concentración en plasma, contribuyendo ambas cosas a una estabilización de la proteína superior a 2,0 kcal/mol. La molécula pequeña puede disminuir también la producción de la amiloidosis y disminuir la tasa de amiloidogénesis mediada por ácidos o mediada por MeOH y/o disminuir la velocidad de disociación de la TTR mediada por urea.

En algunas realizaciones, la molécula pequeña incluye bifenil-aminas, bifenilos, éteres de oxima, benzoxazoles u

otras estructuras compuestas de dos anillos aromáticos, donde uno lleva grupos hidrófilos, tales como un ácido o un fenol, y el otro lleva grupos hidrófobos, tales como varios halógeno o alquilo.

En una realización, el compuesto candidato es un blarllo en donde un anillo lleva uno o más sustituyeles hidrófilos y el otro tiene sustituyeles hidrófobos, o un blarllo en donde los dos anillos llevan al menos un sustltuyente hidrófilo. El grupo hidrófilo puede ser un fenol, un COOH, un alcohol bencílico, un ácido o un áster borónlco, un tetrazol, un aldehido o un aldehido hidratado o un grupo funcional que sirve como donador o aceptor de enlaces de H para la proteína directamente o a través de un enlace de H mediado por agua. El biarilo puede ser un blarllo simétrico que tenga los dos anillos sustituidos con funcionalidad hldróflla Incluyendo fenoles, carboxilatos y alcoholes, y en algunos casos halógenos para rellenar las cavidades de unión a halógeno de la TTR, por ejemplo, un biarilo con la siguiente funcionalidad: 3-CI, 4-OH, 5-CI y 3'-CI, 4'-OH, 5'-CI. En una realización, al menos un anillo del blarllo está sustituido con sustituyeles 2,4-difluoro o 3,5-difluoro o 2,6-dlfluoro o 3,5-dlcloro o 3-CI, 4-OH, 5-CI o 3-F, 4-OH, 5-F, 3-COOH, 4-OH o 3-OH o 3-COOH o 4-COOH o 3-CH2OH o 4-CH2OH. Un biarilo ilustrativo es un bifenllo pollclorado, por ejemplo, un bifenllo policlorado hidroxilado, en donde al menos un anillo lleva sustituyentes OH y/o Cl Incluyendo 3- Cl, 4-OH, 5-CI o 2-CI, 3-CI, 4-OH, 5-CI o 3,4-dlCI o 2,3,4-trlcloro o 2,3,4,5-tetracloro. En el compuesto candidato pueden usarse halógenos distintos de cloro. El compuesto candidato de la presente invención puede ser un benzoxazol.

En una realización, el compuesto candidato es un análogo de dlflunisal. En la presente memoria se describe la estructura del diflunisal, así como una diversidad de análogos de diflunisal. El análogo de diflunisal puede tener opclo- nalmente una actividad de NSAID (fármaco antl-lnflamatorlo no esferoide) reducida o ausente en comparación con el diflunisal. Por ejemplo, el análogo de diflunisal puede tener una actividad inhibidora de la ciclooxlgenasa reducida o ausente en comparación con el diflunisal.

En una realización, el método incluye una etapa adicional para determinar si el análogo de diflunisal presenta actividad de NSAID. Por ejemplo, el método puede Incluir una etapa para determinar si el análogo de diflunisal presenta actividad inhibidora de la ciclooxigenasa.

La transtiretina usada en los métodos de cribado puede ser transtiretina de tipo natural o una transtiretina mutante, tal como una transtiretina mutante natural asociada causalmente con la incidencia de una enfermedad amllolde por transtiretina, tal como la pollneuropatía amllolde familiar o la cardiomiopatía amiloide familiar. Las transtlretlnas mu- tantes naturales ilustrativas Incluyen, pero sin limitación, V122I, V30M, L55P (la nomenclatura de mutantes describe la sustitución en la posición de aminoácido mencionada con respecto al... [Seguir leyendo]

1. Un método de cribar un compuesto que impide o reduce la disociación de un tetrámero de transtiretina, comprendiendo dicho método:

poner en contacto un tetrámero de transtiretina con un compuesto candidato; y

determinar si el compuesto candidato aumenta la energía de activación asociada con la disociación del tetrámero de transtiretina, impidiendo o reduciendo de este modo la disociación del tetrámero de transtiretina.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende determinar si el compuesto impide la disociación del tetrámero de transtiretina desestabilizando el estado de transición de la disociación del tetrámero de transtiretina.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende determinar si el compuesto impide la disociación del tetrámero 10 de transtiretina por estabilización del tetrámero de transtiretina.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además medirla capacidad del compuesto candidato para inhibir la formación de fibrillas.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el tetrámero de transtiretina comprende transtiretina de tipo natural.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el tetrámero de transtiretina comprende transtiretina mutante natural.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el tetrámero de transtiretina comprende una transtiretina mutante natu

ral asociada causalmente con la incidencia de polineuropatía amiloide familiar o de cardiomiopatía amiloide familiar.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el tetrámero de transtiretina comprende la transtiretina mutante V122I, la transtiretina mutante V30M o la transtiretina mutante L55P.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto candidato es un análogo de diflunisal.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el análogo de diflunisal tiene una actividad de NSAID reducida o au

sente o actividad inhibidora de ciclooxigenasa en comparación con el diflunisal.

11. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar si el análogo de diflunisal exhibe actividad de NSAID o el análogo de diflunisal exhibe actividad inhibidora de ciclooxigenasa.

12. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto candidato es un bifenilo policlorado.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el bifenilo policlorado es un bifenilo policlorado hidroxilado.