Composición para el control biológico del oídio en cultivos vegetales a base de una cepa de Ampelomyces.

La presente invención se refiere a una cepa de Ampelomyces aislada a partir de hojas de calabaza,

a su procedimiento de aislamiento, a una composición que la comprende así como a sus usos en el control biológico en cultivos vegetales de plagas causantes de la enfermedad conocida como oídio, preferiblemente en cucurbitáceas (calabacín, calabaza, etc.) pero también en otras familias como por ejemplo las solanáceas, rosáceas, asteráceas, umbelíferas, fabáceas, frutales o cultivos ornamentales.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invenciïn se encuadra en el campo de la biotecnologïa y mïs especïficamente dentro de la agrobiotecnologïa. Especïficamente, se refiere a una cepa de Ampelomyces aislada a partir de hojas de calabaza, a su procedimiento de aislamiento, a una composiciïn que la comprende asï como a sus usos en el control biolïgico en cultivos vegetales de plagas causantes de la enfermedad conocida como oïdio, preferiblemente en cucurbitïceas (calabacïn, calabaza, etc.) pero tambiïn en otras familias como por ejemplo las solanïceas, rosïceas, asterïceas, umbelïferas, fabïceas, frutales o cultivos ornamentales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

El oïdio es una enfermedad causada por el hongo de ese mismo nombre, que actïa sobre hojas y tallos en plantas dïbiles, situadas normalmente a la sombra y en zonas o ïpocas de mucha humedad ambiental. Los oïdios son parïsitos estrictos, nunca se ha conseguido cultivarlos sobre medios nutritivos.

La sintomatologïa se caracteriza por unas manchas blanquecinas y pulverulentas en el haz de las hojas de ciertas especies vegetales que al principio son pequeïas y de forma mïs o menos circular. A medida que la enfermedad avanza, estas manchas van creciendo y cubren todo el aparato vegetativo, hojas y tallos. En casos de ataques excepcionalmente fuertes, pueden verse afectados incluso los frutos.

El oïdio es frecuente en hojas de cucurbitïceas (calabacines, pepinos, melones y sandïas) , aunque a menudo encontramos esa especie de harina blanquecina que va secando las hojas en los rosales, en los brotes tiernos de melocotones o nectarinas y en la vid, entre otras especies vegetales.

En la actualidad existen ciertos agentes activos que se utilizan para tratar esta enfermedad, tales como el imazalil, pirazofos y triforina que actïan muy bien como antioïdios sistïmicos, pero que en la actual revisiïn comunitaria de compuestos fitosanitarios admitidos no han sido incluidos en el Anexo I de la Directiva 91/414/CEE del Consejo, de 15 de julio de 1991, relativa a la comercializaciïn de productos fitosanitarios.

Ademïs, en lo concerniente al tratamiento de diversas plagas, las sustancias quïmicas en numerosas ocasiones no se permiten, ya que cuando se quiere hacer producciïn integrada en un cultivo determinado es prioritario siempre el control biolïgico o biocontrol como medida paliativa de una enfermedad provocada por una plaga.

Por ello, una vez identificado un tipo de enfermedad, sïlo se permitirï el uso de un grupo muy limitado de productos quïmicos para el control de la misma. Asï, en el caso del oïdio, si existe presencia de sïntomas y/o condiciones favorables a la enfermedad, existirïn restricciones referentes a limitaciïn de nïmero de tratamientos con productos de la misma familia quïmica -para evitar la apariciïn de resistencias, segïn recomendaciones de FRAC Fungicide Resistance Action Committee- o no interferir con la entomofauna auxiliar, por ejemplo. Ademïs, si se opta por la agricultura ecolïgica resulta imprescindible utilizar el control biolïgico.

El control biolïgico o biocontrol es un mïtodo de control de plagas, enfermedades y malezas que consiste en utilizar organismos vivos con objeto de controlar las poblaciones de otro organismo. Es un mïtodo agrïcola de control de plagas (insectos, ïcaros, malezas, enfermedades de las plantas, etc.) que usa depredadores, parïsitos, herbïvoros, microorganismos u otros medios naturales que es un componente importante del control integrado de plagas ya que es de gran importancia econïmica para la agricultura.

En lo referente a la colonizaciïn vegetal producida por bacterias, levaduras y hongos, ïsta se puede encontrar en la superficie de las hojas generando una flora epifïtica susceptible de ser eliminada con mayor potencial gracias al control biolïgico, ya que este tipo de agentes pueden adaptarse mïs rïpidamente a los cambios nutricionales y sobre todo son los mïs adaptados a las condiciones ambientales especïficas.

Desde un punto de vista ecolïgico, los hongos son los microorganismos mïs adecuados para poder atacar al oïdio (Bïlanger R.R., Avis T. J. 2002. Ecological processes and interactions occuring in leaf surface fungi. En: Phyllosphere Microbiology. SE Lindow, EI Hecht-Poinar i VJ Elliot Editors. American Phytopathology Society St. Paul. Minn. pp. 193207; Caffi, T., Legler, S.E., BugianI, R., Rossi, V. 2013. Combining sanitation and disease modelling for control of grapevine powder y mildew. European Journal of Plant Pathology,

135: 817-829; Kiss L. 2003. A review of fungal antagonists of powder y mildews and their potential as biocontrol agents. Pest Management Science, 59: 475-483) . Kiss (2003) realizï una revisiïn de la ecologïa, modos de acciïn y eficacia del control biolïgico de aproximadamente 40 especies fïngicas que fueron presentadas como antagonistas naturales del oïdio o probadas como potenciales agentes de biocontrol.

De todas ellas, la perteneciente al gïnero Ampelomyces es la mïs conocida y estudiada como el antagonista natural del oïdio. A diferencia de otros hongos, este micoparïsito actïa directamente por invasiïn y destrucciïn del citoplasma del huïsped. Coloniza y destruye el conidiïforo (estructura asexual) y el ascocarpo inmaduro (estructura sexual) del micelio del oïdio (Kiss L., Russell J.C., Szentivïnyi O., Xu X., Jeffries P. 2004. Biology and biocontrol potential of Ampelomyces mycoparasites, natural antagonists of powder y mildews fungi. Biocontrol Science and Technology, 14: 635-651) .

El mecanismo de acciïn de este agente de control biolïgico es por parasitaciïn del patïgeno, por lo tanto se necesita cierta incidencia de la enfermedad para que el antagonista pueda actuar. Nunca se ha detectado sïntesis de toxinas por parte del gïnero Ampelomyces (Kiss, 2008. Intracellurar mycoparasites in action: interactions between powder y mildew fungi and Ampelomyces. British Mycological Society Symposia Series.

T.B.M. Society: 37-52) .

Cuando se habla de control biolïgico para micoparïsitos siempre se ha de pensar que se debe tolerar una cierta incidencia de la enfermedad ya que estos hongos ïnicamente pueden actuar sobre infecciones ya establecidas (Fokkema N.J. 1993. Opportunities and problems of control of foliar pathogens with microorganisms. Pesticide Science, 37: 411-416; Gilardi, G., Baudino, M., Garibaldi, A., Gullino, M. L. 2012. Efficacy of biocontrol agents and natural compounds against powder y mildew of zucchini. Phytoparasitica, 40:147-155) .

El tiempo que necesita Ampelomyces para actuar contra el oïdio es entre 5-7 dïas. Cuando se produce una propagaciïn o esporulaciïn muy intensa del patïgeno, Ampelomyces no lo puede controlar completamente. Es en estos casos cuando Ampelomyces reduce la severidad de la enfermedad y limita los efectos negativos que produce el oïdio sobre las plantas, pero no erradica la enfermedad.

Este micoparïsito es mïs efectivo cuando la humedad relativa ambiental supera el 80%

(Gilardi G., Manker D.C., Garibaldi A., Gullino M.L. 2008. Efficacy of the biocontrol agents Bacillus subtilis and Ampelomyces quisqualis applied in combination with fungicides against powder y mildew of zucchini. Journal of Plant Diseases and Protection 115: 208-213) . El hecho de ser uno de los agentes de biocontrol mïs estudiados ha provocado que exista un interïs comercial para el desarrollo de composiciones basadas en este hongo.

En Europa hay incluido en el Anexo I un producto formulado a partir de una cepa de Ampelomyces quisqualis M-10 aislada en Israel en el aïo 1989 y distribuido en Europa con el nombre comercial de AQ10ï.

Sin embargo, se han realizado innumerables estudios con este producto para determinar su efectividad contra el oïdio en plantas de cucurbitïceas y vid obteniïndose resultados dispares, poco concluyentes y poco positivos (DIK A.J., VERHAAR M.A., BELANGER R.R., 1998. Comparison of three biological control agents against cucumber powder y mildew (Sphaerotheca fuliginea) in semi-comercial-scale glasshouse trials. European Journal of Plant Pathology, 104: 413-423; ELAD Y., KIRSHNER N., YEHUDA N., SZTEJNBERG A. 1998. Management of powder y mildew and gray mold of cucumber by Trichoderma harzianum T39 and Ampelomyces quisqualis AQ10. BioControl, 43: 241-251 SHISHKOFF N., McGRATH M.T. 2002. AQ10 biofungicide combined with chemical fungicies and AddQ spray adjuvant for control of cucurbit powder y mildew in detached leaf culture. Plant Disease,

86: 915-918; Kiss et al., 2004; ANGELI D., di MARINO E., MAINES L., MESCALCHIN E., 2006. Grapevine powder y mildew and the mycoparasite Ampelomyces quisqualis in Trentino vineyards (nothern Italy) . Bulletin OILB/SROP, 29: 89-92; BRAND...

1. Hongo aislado del gïnero Ampelomyces con el nïmero de depïsito CECT 20749.

2. Mïtodo de aislamiento del hongo de la reivindicaciïn 1 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) . tomar hojas de calabaza infectadas con oïdio (Podosphaera fusca) ,

b) . observar mediante microscopio estereoscïpico las hojas infectadas por oïdio

en busca de alguna zona donde hubiera estructuras similares a picnidios

formadas por el posible agente de biocontrol,

c) . delimitar la zona donde se encuentran dichas estructuras, llamadas picnidios,

y rascar en esa zona la superficie de la hoja con un bisturï sobre un

portaobjetos,

d) . observar los picnidios mediante microscopio estereoscïpico y separar en otro

portaobjetos,

e) . dispersar una gota de etanol 96ï (v/v) durante 15 segundos sobre los

picnidios aislados en el portaobjetos y seguidamente aclarar dicha gota con

agua estïril para eliminar el etanol,

f) . depositar los picnidios aislados en placas Petri con medio MEA o en medio

PDA y,

g) . incubar los picnidios de la etapa f) en condiciones controladas de luz y

temperatura obteniendo la cepa de Ampelomyces CECT 20749.

3. Mïtodo de aislamiento segïn la reivindicaciïn 2 caracterizado porque la cepa de Ampelomyces CECT 20749 aislada se resiembra posteriormente en medio fresco a una temperatura en un intervalo entre 18 y 25 ï C.

4. Mïtodo de aislamiento segïn cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 caracterizado porque la cepa de Ampelomyces CECT 20749 aislada es conservada durante 12 meses en forma de suspensiïn con glicerol al 20% y a una temperatura de al menos -70ïC, siendo necesaria su reactivaciïn antes de que transcurra dicho periodo de tiempo.

5. Composiciïn que comprende el hongo segïn la reivindicaciïn 1.

6. Composiciïn segïn la reivindicaciïn 5 caracterizada porque estï en forma sïlida.

7. Composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 caracterizada porque se conserva en ausencia de conservantes a temperaturas entr.

2. 25ïC.

8. Uso del hongo de la reivindicaciïn 1 o de la composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 como agente para control biolïgico contra las infecciones de oïdio en 5 plantas.

9. Uso segïn la reivindicaciïn 8 donde la planta es de la familia de las cucurbitïceas, solanïceas, rosïceas, asterïceas, umbelïferas, fabïceas, frutales o cultivos ornamentales.

10. Mïtodo de control biolïgico del oïdio de una planta respecto a un control que comprende:

a) . poner en contacto la parte afectada de la planta con una composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, y

b) . dejar actuar la composiciïn de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

11. Mïtodo de control biolïgico segïn la reivindicaciïn 10 caracterizado porque en la etapa a) la composiciïn se pone en contacto con la planta pulverizando una dispersiïn acuosa que 15 la contiene.

12. Mïtodo de control biolïgico segïn la reivindicaciïn 11 caracterizado porque la dispersiïn acuosa contiene una concentraciïn entre 1*107 y 5*106 picnidiosporas/mL de la composiciïn de las reivindicaciones 5 a 7.

13. Uso de la composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para control 20 biolïgico contra las infecciones de oïdio en plantas en un programa de control integrado de plagas.

:n"uuQ nuQrEQ"a" *

u"Qn a Qn!

100 90

a 80 70 60 50 40 30

b b

u 0 CK 106 5*106 107

TrataEuQnto FIG. 1

:n"QrEQ"a" *

uuQ n "Qnuua wn!

80 70 60 50 40 30 20 10 0

a TrataEuQnto FIG. 2

CK CECT 20749 AQ10 CECT 20749 AQ10 CECT20749 AQ10 (255*105pic/mL) (255*105pic/mL) (106 pic/mL) (106 pic/mL) (107 pic/mL) (107 pic/mL)

FIG.4

OFICINA ESPAïOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.ï solicitud: 201430566

ESPAïA

Fecha de presentaciïn de la solicitud: 16.04.2014

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categorïa 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A WO 2014044723 A1 (FOND EDMUND MACH) 27.03.2014, reivindicaciones. 1-13

A US 5190754 A (SZTEJNBERG ABRAHAM) 02.03.1993, reivindicaciones. 1-13

A ANGELI DARIO et al. Existence of different physiological forms within genetically diverse strains of Ampelomyces quisqualis. Phytoparasitica. 2012. VOL: 40 No: 1 Pïgs.

3. 51 ISSN 0334-2123 (print) ISSN 1876-7184 (electronic) Doi: doi:10.1007/s12600-011-0197-x, resumen. 1-13

A GOPALAKRISHNAN C et al. Management of okra powder y mildew using Ampelomyces quisqualis. Journal of Biological Control. 2009. VOL: 23 No: 3 Pïgs.

32. 327 ISSN 0971-930X (print) ISSN 0970-5732 (electronic) , resumen. 1-13

A ANGELI DARIO et al. Is the mycoparasitic activity of Ampelomyces quisqualis biocontrol strains related to phylogeny and hydrolytic enzyme production. Biological Control. 2012.VOL: 63 No: 3 Pïgs.

34. 358 ISSN 1049-9644 (print) ISSN 1090-2112 (electronic) Doi: doi:10.1016/j.biocontrol.2012.08.010, resumen. 1-13

Categorïa de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categorïa A: refleja el estado de la tïcnica O: referido a divulgaciïn no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaciïn de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despuïs de la fecha de presentaciïn de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nï:

Fecha de realizaciïn del informe 13.06.2014 Examinador I. Rueda Molïns Pïgina 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TïCNICA

Nï de solicitud: 201430566

CLASIFICACIïN OBJETO DE LA SOLICITUD A01N63/04 (2006.01)

C12N1/14 (2006.01) C12R1/645 (2006.01) Documentaciïn mïnima buscada (sistema de clasificaciïn seguido de los sïmbolos de clasificaciïn)

A01N, C12N, C12R

Bases de datos electrïnicas consultadas durante la bïsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, tïrminos de bïsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS

Informe del Estado de la Tïcnica Pïgina 2/4

OPINIïN ESCRITA

Nï de solicitud: 201430566

Fecha de Realizaciïn de la Opiniïn Escrita: 13.06.2014

Declaraciïn

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-13 Reivindicaciones SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-13 Reivindicaciones SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaciïn industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tïcnico de la solicitud (Artïculo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opiniïn.

La presente opiniïn se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Tïcnica Pïgina 3/4

OPINIïN ESCRITA

Nï de solicitud: 201430566

1. Documentos considerados.

A continuaciïn se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la tïcnica tomados en consideraciïn para la realizaciïn de esta opiniïn.

Documento Nïmero Publicaciïn o Identificaciïn Fecha Publicaciïn

D01 WO 2014044723 A1 (FOND EDMUND MACH) 27.03.2014

D02 US 5190754 A (SZTEJNBERG ABRAHAM) 02.03.1993

D03 ANGELI DARIO et al. Existence of different physiological forms within genetically diverse strains of Ampelomyces quisqualis. Phytoparasitica. VOL: 40 No: 1 Pïgs.

3. 51 ISSN 0334-2123 (print) ISSN1876-7184 (electronic) Doi: doi:10.1007/s12600-011-0197-x 2012

D04 GOPALAKRISHNAN C et al. Management of okra powder y mildew using Ampelomyces quisqualis. Journal of Biological Control. VOL: 23 No: 3 Pïgs:325-327 ISSN 0971-930X (print) ISSN 0970-5732 (electronic) , resumen. 2009

D05 ANGELI DARIO et al. Is the mycoparasitic activity of Ampelomyces quisqualis biocontrol strains related to phylogeny and hydrolytic enzyme production. Biological Control VOL: 63 No: 3 Pïgs:348-358 ISSN 1049-9644 (print) ISSN 1090-2112 (electronic) Doi: doi:10.1016/j.biocontrol.2012.08.010, resumen. 2012

2. Declaraciïn motivada segïn los artïculos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecuciïn de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciïn

NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (artïculos 6 y 8 de la Ley 11/1986)

En las reivindicaciones 1, 5-7 de la solicitud de patente se reivindica un hongo del gïnero Ampelomyces con el nïmero de depïsito CECT 20749 y una composiciïn que comprende dicho hongo.

En las reivindicaciones 2-4 de la solicitud de patente se reivindica el mïtodo de aislamiento del citado hongo.

En las reivindicaciones 8, 9 y 13 de la solicitud de patente se reivindica el uso de dicho hongo o de la citada composiciïn, para el control biolïgico contra las infecciones de oïdio.

En las reivindicaciones 10-12 de la solicitud de patente se reivindica un mïtodo de control biolïgico de oïdio que emplea el hongo objeto de la invenciïn.

Cualquiera de los documentos citados, D01-D05, refleja el uso de diferentes cepas de Ampelomyces para el control biolïgico del oïdio.

El hongo Ampelomyces con el nïmero de depïsito CECT 20749 objeto de la invenciïn es una cepa autïctona aislada en Espaïa, tal y como se indica en la pïgina 5 de la descripciïn de la solicitud de patente. La cepa objeto de la invenciïn presenta un alto grado de eficacia tal y como reflejan los ïndices de incidencia de la enfermedad que se muestran en las figuras de la solicitud de patente. En ninguno de los documentos citados se refleja una cepa de Ampelomyces que presenta idïnticas o similares caracterïsticas a la cepa objeto de la invenciïn. Por tanto, las reivindicaciones 1-13 de la solicitud de patente presentan novedad y actividad inventiva, segïn lo establecido en los artïculos 6 y 8 de la Ley 11/1986.

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