Composición de subtilisina estabilizada.

Composición que comprende una subtilisina y un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído con la fórmula X-B1-NHCHR- CHOH-SO3M,

donde:

A) M es H (hidrógeno) o un metal alcalino;

B) R es un grupo de manera que NH-CHR-CO es un residuo de L o D-aminoácido;

C) B1 es un residuo de aminoácido; y

D) X consiste en uno o más residuos de aminoácidos, que comprenden opcionalmente un grupo de protección N-terminal.

Composición de subtilisina estabilizada Referencia a un listado de secuencias [0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en forma legible por ordenador.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición que comprende una subtilisina que es estabilizada por un derivado de péptido-aldehído. También se refiere a un método para preparar la composición y a un compuesto para su uso en la composición.

Antecedentes de la invención [0003] La WO 98/13458, WO 94/04651, WO 98/13460, WO 95/25791 y WO 2009/118375 divulgan detergentes líquidos con una proteasa tipo subtilisina estabilizada por un péptido-aldehído. La WO 2011/036153 divulga que la adición de un péptido-aldehído a un detergente que contiene subtilisina granuloso puede mejorar la detergencia.

Se conoce bien que los aldehídos pueden formar aductos solubles con NaHSO3 (aductos de bisulfito o hidrosulfito) y que los péptido-aldehídos tienden a ser moderadamente solubles en agua.

La WO 98/47523 y la US 6.500.802 revelan ácidos peptidil-2-amino-1-hidroxialcanosulfónicos y su uso como inhibidores de proteasa. La US 5.436.229 divulga aductos de bisulfito de derivados de L-arginina aldehído y su uso como inhibidores de trombina. La US 4.691.007 divulga aductos de bisulfito de tetrapéptido aldehídos útiles como inhibidores de leucocito elastasa humana.

La US 4.703.036, la US 4.478.745 y la US 5.578.574 divulgan métodos para preparar péptido aldehídos en forma seca.

Resumen de la invención [0007] En la producción a gran escala de composiciones de subtilisina estabilizada es muy preferible manejar materias primas líquidas, tanto por seguridad como por consideraciones de proceso. Los péptido aldehídos tienden a ser moderadamente solubles en agua, lo que hace la preparación de soluciones acuosas concentradas difícil o imposible y es necesario el uso de producto bien secos o soluciones acuosas altamente diluidas cuando se hacen soluciones de subtilisina estabilizada para el uso en formulaciones líquidas o para granulación para hacer composiciones granulosas.

La conversión del péptido aldehído en un aducto de hidrosulfito puede utilizarse para aumentar la solubilidad acuosa en la purificación de los péptido aldehídos. Ventajosamente, hemos descubierto que este aducto de hidrosulfito es en sí eficaz como inhibidor y estabilizador de subtilisina y que puede también estabilizar una segunda enzima (no subtilisina) si está presente. Hemos descubierto que el aducto de hidrosulfito es eficaz como inhibidor de subtilisina, y hemos descubierto que mantiene su efecto inhibitorio y estabilizante en un detergente líquido durante el almacenamiento. Así, el uso del aducto de hidrosulfito puede evitar el coste y el tiempo de convertirlo de nuevo en el péptido aldehído y el secado posterior del péptido aldehído se puede ahorrar, y se puede evitar el inconveniente de manipulación del péptido aldehído en polvo o como solución acuosa altamente diluida. Además, la adición de un aducto de bisulfito de péptido aldehído también puede mejorar la detergencia (rendimiento de lavado) de un detergente que contiene subtilisina.

Por consiguiente, la invención proporciona una composición que comprende una subtilisina y un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído, que tiene la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M. Los grupos de la fórmula tienen el siguiente significado:

a) M es H (hidrógeno) o un metal alcalino, preferiblemente Na o K;

b) R es un grupo de manera que NH-CHR-CO es un residuo de L o D-aminoácido (en el siguiente denominado B0) ;

c) B1 es un residuo de aminoácido; y d) X consiste en uno o varios residuos de aminoácidos (preferiblemente uno o dos) , opcionalmente incluyen un grupo de protección N-terminal.

La invención proporciona además un método para preparar la composición, este método comprende la mezcla de una subtilisina, una solución acuosa que comprende un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído con la fórmula X-B1NH-CHR-CHOH-SO3M (donde M, R, B1 y X se definen como por encima) , y opcionalmente un surfactante.

Adicionalmente, la invención proporciona un compuesto para su uso en la composición, este compuesto es un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído con la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH SO3M. R puede ser p-hidroxi-bencilo y M, B1 y X se definen como por encima.

Descripción detallada de la invención Composición de subtilisina estabilizada [0012] La composición de la invención comprende una subtilisina y un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído, y éste puede opcionalmente comprender una segunda enzima. La composición puede ser en forma líquida o granulosa. Puede ser una composición de detergente que comprenda además un surfactante.

En una composición tal como un líquido o detergente granuloso, la cantidad de cada enzima (subtilisina y segunda enzima opcional) será típicamente de 0, 04-80 micro-M (o micromol/kg) , en particular 0, 2-30 micro-M, especialmente 0, 4-20 micro-M (generalmente 1-2000 mg/l o mg/kg, en particular 5-750 mg/l, especialmente 10-500 mg/l) calculado como proteína enzimática pura. En una composición tal como un concentrado enzimático la cantidad de cada enzima será típicamente 0, 01-20 mM, en particular 0, 04-10 mM, especialmente 0, 1-5 mM (generalmente 0, 3-500 g/l, en particular 1-300 g/l, especialmente 3-150 g/l) calculado como proteína enzimática pura.

La proporción molar de estabilizador o inhibidor de enzima según la invención en subtilisina es al menos 1:1 o 1, 5:1, y es menor que 1000:1, más preferido menor que 500:1, más preferido incluso de 100:1 a 2:1 o de 20:1 a 2:1, o más preferido, la proporción molar es de 10:1 a 3:1.

Péptido aldehído [0015] El aducto bisulfito usado en el método se puede derivar de un péptido aldehído con la fórmula X-B1-B0-H donde los grupos se definen como arriba con B0 siendo un residuo de aminoácido único con configuración L o D con la fórmula: NH-CHR-CO.

NH-CHR-CO (B0) es un residuo de L o D-aminoácido, donde R puede ser una cadena lateral alifática o aromática, por ejemplo, aralquilo tal como bencilo, donde R se puede sustituir opcionalmente. Más particularmente, el residuo B0 puede ser voluminoso, neutro, polar, hidrofóbico y/o aromático, opcionalmente sustituido. Ejemplos son la L o D-forma de Tyr (p-tirosina) , m-tirosina, 3, 4-dihidroxifenilalanina, Phe, Val, Met, norvalina (Nva) , Leu, Ile o norleucina (Nle) ; particularmente Tyr, m-tirosina, 3, 4-dihidroxifenilalanina, Phe, Val, Met, Nva o Nle.

En la fórmula anterior, X-B1-B0-H, el residuo B1 puede ser particularmente pequeño, alifático hidrofóbico y/o neutro. Ejemplos son alanina (Ala) , cisteína (Cys) , glicina (Gly) , prolina (Pro) , serina (Ser) , treonina (Thr) , valina (Val) , norvalina (Nva) y norleucina (Nle) ; particularmente Ala, Cys, Gly, Ser, Thr, Val, Nva y Nle.

X puede en particular ser uno o dos residuos de aminoácidos con un grupo de protección N-terminal opcional (es decir, el compuesto es un tri-o tetrapéptido aldehído con o sin un grupo de protección) . Así, X puede ser B2, B3-B2, Z-B2, Z-B3-B2donde B3y B2cada uno representa un residuo de aminoácido, y Z es un grupo de protección N-terminal.

El residuo B2 puede en particular ser pequeño, alifático y/o neutro, por ejemplo, Ala, Gly, Thr, Arg, Leu, Phe o Val; particularmente Gly, Thr o Val.

El residuo B3 puede en particular ser voluminoso, hidrofóbico, neutro y/o aromático, opcionalmente sustituido, por ejemplo, Phe, Tyr, Trp, fenilglicina, Leu, Val, Nva, Nle o Ile.

El grupo Z de protección N-terminal (si está presente) se puede seleccionar de formilo, acetilo (Ac) , benzoilo, trifluoroacetilo, fluorometoxi carbonilo, metoxisuccinilo, grupos protectores de uretano aromáticos y alifáticos, benciloxicarbonilo Cbz) , t-butiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, p-metoxibencil carbonilo (MOZ) , bencilo (Bn) , pmetoxibencilo (PMB) o p-metoxifenilo (PMP) , metoxicarbonilo (Moc) ; metoxiacetilo (Mac) ; metil carbamato o un grupo de urea de metilamino carbonil/metil. En el caso de un tetrapéptido aldehído con un grupo de protección (es decir X = Z-B3-B2) , Z es preferiblemente un grupo alifático pequeño, por ejemplo, formilo, acetilo, fluorometoxi carbonilo, tbutiloxicarbonilo, metoxicarbonilo (Moc) , metoxiacetilo (Mac) , metil carbamato o un grupo de urea de metilamino carbonil/metil. En el caso de un tripéptido aldehído con un grupo de protección (es decir X = Z-B2) , Z es preferiblemente un grupo aromático voluminoso tal como, benzoilo, benciloxicarbonilo, p-metoxibencilo carbonilo (MOZ) , bencilo (Bn) , pmetoxibencilo (PMB) o p-metoxifenilo (PMP) .

Péptido aldehídos adecuados se describen en... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende una subtilisina y un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído con la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M, donde:

A) M es H (hidrógeno) o un metal alcalino; B) R es un grupo de manera que NH-CHR-CO es un residuo de L o D-aminoácido; C) B1 es un residuo de aminoácido; y D) X consiste en uno o más residuos de aminoácidos, que comprenden opcionalmente un grupo de protección Nterminal.

2. Composición según la reivindicación precedente, donde R es un grupo de manera que NH-CHR-CO es un residuo de L o D-aminoácido de Tyr, m-tirosina, 3, 4-dihidroxifenilalanina, Phe, Val, Met, Nva, Leu, Ile o Nle.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde B1 es un residuo de Ala, Cys, Gly, Pro, Ser, Thr, Val, Nva o Nle.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde X es B2, B3-B2, Z-B2 o Z-B3-B2, donde B2 y B3 cada uno representa un residuo de aminoácido, y Z es un grupo de protección N-terminal.

5. Composición según la reivindicación precedente, donde B2 es un residuo de Val, Gly, Ala, Arg, Leu, Phe o Thr.

6. Composición según la reivindicación 4, donde B3 es un residuo de Phe, Tyr, Trp, fenilglicina, Leu, Val, Nva, Nle o Ile.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde Z es benciloxicarbonilo (Cbz) , pmetoxibencilocarbonilo (MOZ) , bencilo (Bn) , benzoilo (Bz) , p-metoxibencilo (PMB) , p-metoxifenilo (PMP) , formilo, acetilo (Ac) , metiloxi o metiloxicarbonilo.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está en forma líquida o granulosa.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un detergente que comprende además un surfactante.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además una segunda enzima, particularmente una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una pectato liasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, una lacasa o una peroxidasa.

11. Método para preparar la composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, dicho método comprende la mezcla de una subtilisina, una solución acuosa que comprende un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído que tiene la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M, donde M, R, B1 y X se definen como en la reivindicación 1, y opcionalmente un surfactante.

12. Compuesto para su uso en la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, este compuesto es un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído que tiene la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M, donde M y X se definen como en la reivindicación 1, B1 es un residuo de aminoácido que es diferente de prolina (Pro) , y R es un grupo de manera que NH-CHR-CO es un residuo de L o D-aminoácido de Tyr, m-tirosina, 3, 4-dihidroxifenilalanina, Phe, Val, Met, Nva o Nle.

13. Compuesto según la reivindicación 12, que es Cbz-RA-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Ac-GA-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-GA-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-GG-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-RV-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-LV-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Ac-LGA-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Ac-FGA-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Ac-YGA-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, Ac-FGV-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H o Ac-WLV-NHCH (CH2C6H4OH) C (OH) (SO3M) -H, donde Ac es acetilo y Cbz es benciloxicarbonilo.

14. Compuesto para su uso en la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, este compuesto es un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído que tiene la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M, donde M, R y X se definen como en la reivindicación 1, y donde B1 es un residuo de aminoácido de alanina (Ala) , cisteína (Cys) , glicina (Gly) , serina (Ser) , treonina (Thr) , valina (Val) , norvalina (Nva) y norleucina (Nle) .

15. Compuesto de la reivindicación 14, que es Cbz-GA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-VA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-GA-NHCH (CH2Ph) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-GA-NHCH (CH (CH3) 2) C (OH) (SO3M) -H, Cbz-GG-NHCH (CH2Ph) C (OH) (SO3M) -H, Ac-FGA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, Ac-FGA-NHCH (CH2Ph) C (OH) (SO3M) -H, Ac-FGA-NHCH (CH2CH2SCH3) (SO3M) -H, MeO-CO-VA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, MeNCO-VA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, MeO-CO

FGA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) -C (OH) (SO3M) -H, MeO-CO-FGA-NHCH (CH2Ph) C (OH) (SO3M) -H, MeSO2-FGA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, MeSO2-VA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, PhCH2O (OH) (O) P-VA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, EtSO2-FGA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, PhCH2SO2-VA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, PhCH2O (OH) (O) P-LA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H, PhCH2O (OH) (O) P-FA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) C (OH) (SO3M) -H y MeO (OH) (O) P-LGA-NHCH (CH2CH (CH3) 2) ) -C (OH) (SO3M) -H, donde Ac es acetilo y Cbz es benciloxicarbonilo.

16. Compuesto para su uso en la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, este compuesto es un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído que tiene la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M; donde R y M se definen como en la reivindicación 1; B1 representa un residuo de aminoácido que es diferente de prolina (Pro) ; X es B2, B3-B2, Z-B2, Z-B3-B2, donde B3y B2 cada uno representa un residuo de aminoácido, y Z es un grupo de protección N-terminal; y donde B2 es Gly, Thr o Val.

17. Compuesto para su uso en la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, este compuesto es un aducto de hidrosulfito de péptido aldehído que tiene la fórmula X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M; donde R y M se definen como en la reivindicación 1; B1 representa un residuo de aminoácido que es diferente de prolina (Pro) ; X es B3-B2, Z-B3-B2, donde B3 y B2cada uno representa un residuo de aminoácido, y Z es un grupo de protección N-terminal; y donde B3 es Phe, Tyr, Trp, fenilglicina, Leu, Val, Nva, Nle o Ile.