Complejos moleculares diméricos.

Un complejo molecular dimérico que comprende una primera y una segunda proteína de fusión,

en el que cada proteína de fusión comprende de su extremo N a C:

(A) un resto efector biológico seleccionado del grupo que consiste en:

(1) un anticuerpo monocatenario;

(2) un fragmento Fab;

(3) un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I;

(4) una citocina;

(5) una quimiocina;

(6) una enzima;

(7) una toxina; y

(8) un marcador detectable;

(B) una región bisagra de una molécula de IgG unida al resto efector biológico; y

(C) un dominio de dimerización CH4 de una molécula de IgE covalentemente unido a la región bisagra, en el que el complejo molecular comprende un enlace disulfuro entre un residuo de cisteína en la región bisagra de la primera proteína de fusión y un residuo de cisteína en la región bisagra de la segunda proteína de fusión.

Complejos moleculares dimïricos

Resumen de la invenciïn La presente invenciïn proporciona complejos moleculares dimïricos que comprenden una primera y segunda proteïna de fusiïn, en los que cada proteïna de fusiïn comprende de su extremo N a C (a) un resto efector biolïgico, (b) una regiïn bisagra de una molïcula de IgG unida al resto efector biolïgico y (c) un dominio de dimerizaciïn CH4 de una molïcula de IgE covalentemente unido a la regiïn bisagra, en los que el complejo molecular comprende un enlace disulfuro entre un residuo de cisteïna en la regiïn bisagra de la primera proteïna de fusiïn y un residuo de cisteïna en la regiïn bisagra de la segunda proteïna de fusiïn.

Restos efectores biolïgicos preferidos son un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I, una citocina, una quimiocina, una enzima, una toxina o un marcador detectable. Restos efectores biolïgicos mïs preferidos son un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, una toxina o un marcador detectable.

En una realizaciïn, el complejo molecular dimïrico de la invenciïn comprende dos proteïnas de fusiïn que comprenden cada una restos efectores biolïgicos idïnticos. En otra realizaciïn, las dos proteïnas de fusiïn dentro del complejo comprenden cada una diferentes restos efectores biolïgicos. En una realizaciïn preferida, los restos efectores biolïgicos son sitios de uniïn al antïgeno, con tanto las mismas especificidades de uniïn como diferentes.

Cada proteïna de fusiïn comprende una regiïn bisagra que comprende los residuos de aminoïcidos 223 a 243 de SEC ID Nï: 25, en la que las posiciones 240-243 estïn ocupadas por el tetrapïptido VFLF. En realizaciones preferidas,

el tetrapïptido VFLF se sustituye con un tetrapïptido seleccionado del grupo que consiste en DSEY, KSKY, DEEY y KRKY. Son mïs preferidas realizaciones en las que el tetrapïptido es DSEY o KSKY.

En otro aspecto, la invenciïn proporciona molïculas de ïcidos nucleicos que codifican las proteïnas de fusiïn que comprenden los complejos moleculares dimïricos. En una realizaciïn, una molïcula de ïcido nucleico codifica la proteïna de fusiïn de SEC ID Nï: 1.

En otro aspecto, la invenciïn proporciona composiciones farmacïuticas que incluyen los complejos moleculares dimïricos objeto.

Breve descripciïn de las figuras FIGS. 1A-D. Dibujos esquemïticos de diversos complejos moleculares dimïricos. En cada caso, enlaces disulfuro se forman entre las cisteïnas en la regiïn bisagra de las proteïnas de fusiïn que comprenden el complejo. FIG. 30 1A, un complejo molecular dimïrico en el que el resto efector biolïgico es un anticuerpo monocatenario. FIG. 1B, dos complejos moleculares dimïricos monoespecïficos en los que el resto efector biolïgico es un fragmento Fab; los complejos se diferencian entre sï en la secuencia usada para sustituir el tetrapïptido VFLF “natural” dentro de la bisagra. FIG. 1C, un complejo molecular dimïrico biespecïfico en el que los restos efectores biolïgicos son dos fragmentos Fab diferentes y en el que cada proteïna de fusiïn comprende ademïs una variante de corte y

empalme de IgE M2" diferente en su extremo C (SEC ID Nï: 26 y 27) . FIG. 1D, un complejo molecular dimïrico en el que el resto efector biolïgico es un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I.

FIG. 2. Esquema que muestra la generaciïn del anticuerpo monocatenario 19G9scFv. Las regiones VH y VL se amplificaron por PCR usando cebadores que introdujeron sitios de restricciïn y sitios para solapar la extensiïn del ligador de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID Nï: 8) . Tras 15 ciclos de extensiïn, scFv se amplificï con los cebadores directos e inversos originales mostrados durante 35 ciclos y luego se clonï por digestiïn con restricciïn en el vector de expresiïn bacteriano pz613. Cebador directo de VH, SEC ID Nï: 15; cebador inverso de VH, SEC ID Nï: 16; cebador directo de VL, SEC ID Nï: 17; cebador inverso de VL, SEC ID Nï: 18.

FIG. 3A-B. Esquemas que muestran la construcciïn de construcciones del dominio de dimerizaciïn CH4 de IgE usadas para preparar el complejo molecular dimïrico que contiene el anticuerpo monocatenario 19G9scFv. FIG. 45 4A, construcciïn de un dominio de dimerizaciïn CH4 de IgE fusionado con una bisagra de IgG1. Cebador de ATG001, SEC ID Nï: 9; cebador de ATG003, SEC ID Nï: 11; cebador de ATG004, SEC ID Nï: 12; cebador de ATG006, SEC ID Nï: 13. FIG. 4B, construcciïn de un dominio de dimerizaciïn CH4 de IgE fusionado con una bisagra de IgG con cuatro aminoïcidos mutados para crear una bisagra mïs hidrïfila (cebador de ATG019, SEC ID Nï: 14) . La inserciïn muestra la secuencia alrededor del sitio de mutaciïn que incluye tanto la secuencia de 50 aminoïcidos, aminoïcidos 252-281 de SEC ID Nï: 1, como la secuencia de nucleïtidos (nucleïtidos 783-869 de SEC ID Nï: 2) .

FIGS. 4A-B. Secuencias de dos proteïnas de fusiïn 19G9scFv. FIG. 5A, la secuencia de aminoïcidos en la parte inferior (SEC ID Nï: 3) y la secuencia de ïcidos nucleicos en la parte superior (SEC ID Nï: 4) de la proteïna de fusiïn 19G9scFv “natural” contienen las regiones VH, cursiva negrita; ligador de scFv, cursiva negrita subrayado; extensiïn de VL y del extremo C, negrita; bisagra de IgG, cursiva, con tetrapïptido “natural” subrayado en negrita; CH4 de IgE, sencillo; marca de epïtope del extremo C, subrayado cursiva. FIG. 5B, la secuencia de aminoïcidos en la parte inferior (SEC ID Nï: 1) y secuencia de ïcidos nucleicos en la parte superior (SEC ID Nï: 2) de la proteïna de fusiïn 19G9scFv “mutante” contiene las regiones VH, cursiva en negrita; ligador de scFv, cursiva en negrita subrayado; extensiïn de VL y del extremo C, negrita; bisagra de IgG, cursiva, con sustituciïn de tetrapïptidos hidrïfilos subrayado en negrita; CH4 de IgE, sencillo; marca de epïtope del extremo C, subrayado cursiva.

FIG. 5A-B. Caracterizaciïn de un complejo molecular dimïrico purificado que comprende dos proteïnas de fusiïn que contienen el anticuerpo monocatenario 19G9scFv (algunas veces denominado complejo molecular dimïrico 19G9scFv) . FIG. 6A, perfil de cromatografïa de exclusiïn por tamaïo (SEC) , que indica que la proteïna pura es principalmente un dïmero (º90 kDa basado en tiempos de eluciïn de patrones de peso molecular) . FIG. 6B, el anïlisis de SDS-PAGE de proteïna de fusiïn 19G9scFv no reducida (carriles 2 y 3, que contienen 2 μl y 5 μl de proteïna, respectivamente) y proteïna de fusiïn 19G9scFv reducida (carriles 5 y 6, que contienen 2μl y 5 μl de proteïna, respectivamente) estï de acuerdo con el peso molecular calculado del complejo dimïrico (85, 4 kDa) y del monïmero de la proteïna de fusiïn 19G9scFv (42, 7 kDa) . Los carriles 1 y 7 contienen marcadores de peso molecular.

FIG. 6. Grïfica que muestra datos de ELISA del complejo molecular dimïrico 19G9scFv purificado (triïngulos blancos) que se une a proteïna BHK-RG-1 en comparaciïn con la uniïn del diacuerpo 19G9 correspondiente (cuadrados rellenos) . Gran parte de la secuencia del diacuerpo 19G9 es similar a la secuencia de 19G9 scfv (aminoïcidos 1-251 en SEC ID Nï: 1) . Sin embargo, el ligador entre los dominios VH y VL en el diacuerpo solo tiene 5 aminoïcidos en longitud (GGGGS) .

FIG. 7. Diagrama del vector pPEP MF-J DSEY2 usado para expresar el complejo de dïmeros de Fab, como se 25 muestra esquemïticamente en la FIG. 1B.

FIG. 8. Bio-distribuciïn in vivo del complejo molecular dimïrico 19G9scFv en comparaciïn con otros formatos de anticuerpo (IgG de 19G9, anticuerpo monocatenario scFv monomïrico 19G9 y diacuerpo 19G9) . El eje Y representa el porcentaje promedio de dosis inyectada por gramo (% medio de DI por gramo) para cuatro tejidos: sangre (S) , tumor (T) , hïgado (H) y riïïn (R) . Los valores se muestran para tejidos recogidos 0, 25, 3, 6 y 48 h tras la inyecciïn de 2 μCi de anticuerpo marcado con 111In por animal. El % de DI por gramo para la muestra tumoral de 48 h se indica con una flecha. Mientras que el tumor se marca bien por tanto el complejo molecular dimïrico 19G9 scFv como IgG de 19G9, un alto porcentaje de IgG de 19G9 tambiïn es retenido en la sangre 48 h, a diferencia del complejo molecular dimïrico. scFv y el diacuerpo no marcan bien el tumor y tambiïn producen una acumulaciïn de marca en los riïones.

FIG. 9. Esquema que muestra la generaciïn del plïsmido pIE-J_DSEY usado para expresar la proteïna de fusiïn J_DSEY, como se describe en el Ejemplo 5.

FIG. 10. Uniïn del complejo molecular dimïrico J_DSEY a la proteïna de antïgeno biotinilado para la proteïna ABJ de anticuerpo en comparaciïn... [Seguir leyendo]

1. Un complejo molecular dimïrico que comprende una primera y una segunda proteïna de fusiïn, en el que cada proteïna de fusiïn comprende de su extremo N a C:

(A) un resto efector biolïgico seleccionado del grupo que consiste en: 5 (1) un anticuerpo monocatenario;

(2) un fragmento Fab;

(3) un dominio extracelular de un receptor de membrana de tipo I;

(4) una citocina;

(5) una quimiocina; 10 (6) una enzima;

(7) una toxina; y

(8) un marcador detectable;

(B) una regiïn bisagra de una molïcula de IgG unida al resto efector biolïgico; y

(C) un dominio de dimerizaciïn CH4 de una molïcula de IgE covalentemente unido a la regiïn bisagra, en el que

el complejo molecular comprende un enlace disulfuro entre un residuo de cisteïna en la regiïn bisagra de la primera proteïna de fusiïn y un residuo de cisteïna en la regiïn bisagra de la segunda proteïna de fusiïn.

2. El complejo molecular de la reivindicaciïn 1, en el que los restos efectores biolïgicos de la primera y segunda proteïnas de fusiïn son idïnticos.

3. El complejo molecular de la reivindicaciïn 1, en el que los restos efectores biolïgicos de la primera y segunda 20 proteïnas de fusiïn son diferentes.

4. El complejo molecular de la reivindicaciïn 1, en el que los restos efectores biolïgicos de la primera y segunda proteïnas de fusiïn comprenden cada uno un sitio de uniïn al antïgeno.

5. El complejo molecular de la reivindicaciïn 4, en el que los dos sitios de uniïn al antïgeno tienen la misma especificidad.

6. El complejo molecular de la reivindicaciïn 1, en el que la regiïn bisagra de tanto la primera como la segunda proteïnas de fusiïn es de una molïcula de IgG1.

7. El complejo molecular de la reivindicaciïn 6, en el que la regiïn bisagra comprende los residuos de aminoïcidos 223 a 243 de SEC ID Nï: 25.

8. El complejo molecular de la reivindicaciïn 6, en el que dentro de la regiïn bisagra de al menos una de las dos

proteïnas de fusiïn, el tetrapïptido VFLF, que ocupa las posicione.

24. 243 en la IgG, la regiïn bisagra (SEC ID Nï: 25) , se sustituye con un tetrapïptido seleccionado del grupo que consiste en DSEY, KSKY 1CSEY, DSCY, DEEY, KRKY, SESE, SDSD, SKSK, SRSR, SESY, SDSY, SKSY, SRSY, DDDY, DDEY, DEDY, EEEY, EDDY, EDEY, EEDY, RRRY, RKRY, RRKY, RKKY, KKKY, KRRY, KRKY y KKRY.

9. El complejo molecular de la reivindicaciïn 8, en el que el tetrapïptido es KSKY.

10. El complejo molecular de la reivindicaciïn 8, en el que el tetrapïptido VFLF dentro de la regiïn bisagra de tanto la primera como la segunda proteïnas de fusiïn se sustituye con el mismo tetrapïptido.

11. El complejo molecular de la reivindicaciïn 10, en el que el tetrapïptido de sustituciïn estï seleccionado del grupo que consiste en DSEY, KSKY, DEEY y KRKY.

12. El complejo molecular de la reivindicaciïn 8, en el que el tetrapïptido VFLF dentro de la regiïn bisagra de cada una 40 de la primera y segunda proteïnas de fusiïn se sustituye con un tetrapïptido diferente.

13. El complejo molecular de la reivindicaciïn 12, en el que el tetrapïptido VFLF dentro de la regiïn bisagra de la primera proteïna de fusiïn se sustituye con el tetrapïptido DSEY y dentro de la regiïn bisagra de la segunda proteïna de fusiïn se sustituye con el tetrapïptido KSKY.

14. El complejo molecular de la reivindicaciïn 9, que comprende ademïs un resto covalentemente unido a una lisina en la regiïn bisagra, en el que el resto es una toxina o un poliglicol.

15. El complejo molecular de la reivindicaciïn 1, que comprende ademïs una marca de epïtope en su extremo C.

16. El complejo molecular de la reivindicaciïn 15, en el que la marca de epïtope comprende GAPVPYPDPLEPRAA 5 (SEC ID Nï: 23) .

17. El complejo molecular de la reivindicaciïn 1, que comprende ademïs una variante de corte y empalme de IgE M2" que tiene la secuencia de SEC ID Nï: 26 en el extremo C de la primera proteïna de fusiïn y una variante de corte y empalme de IgE M2" diferente que tiene la secuencia de SEC ID Nï: 27 en el extremo C de la segunda proteïna de fusiïn.

18. El complejo molecular de la reivindicaciïn 1, que comprende ademïs un ligador de aminoïcidos entre el resto efector biolïgico y la regiïn bisagra, en el que el ligador estï covalentemente unido al extremo C del resto efector y el extremo N de la regiïn bisagra.

19. El complejo molecular de la reivindicaciïn 5, en el que tanto la primera como la segunda proteïnas de fusiïn comprenden la secuencia de aminoïcidos de SEC ID Nï: 1.

20. El complejo molecular de la reivindicaciïn 5, en el que tanto la primera como la segunda proteïnas de fusiïn estïn codificadas por la secuencia de nucleïtidos de SEC ID Nï: 2.

21. El complejo molecular de la reivindicaciïn 19, en el que los residuos de aminoïcidos en las posicione.

27. 281 de SEC ID Nï: 1 (DSEYP) se sustituyen con residuos de aminoïcidos KTSG (residuo.

31. 318 de SEC ID Nï: 45) o con residuos de aminoïcidos TKTSG (residuo.

31. 318 de SEC ID Nï: 45) .

22. El complejo molecular de la reivindicaciïn 5, en el que tanto la primera como la segunda proteïnas de fusiïn estïn codificadas por la secuencia de nucleïtidos de SEC ID Nï: 22.

23. El complejo molecular de la reivindicaciïn 22, en el que los residuos de aminoïcidos en las posiciones 263 a 267 de SEC ID Nï: 20 se sustituyen con residuos de aminoïcidos KTSG (residuo.

31. 318 de SEC ID Nï: 45) o con residuos de aminoïcidos TKTSG (residuo.

31. 318 de SEC ID Nï: 45) .

24. Una composiciïn farmacïutica que comprende: el complejo molecular dimïrico de la reivindicaciïn 1 y un vehïculo farmacïuticamente aceptable.