Colagenasa de fusión a la que se une una marca de afinidad, y método para producir la misma.

Un método para producir una colagenasa de fusión,

en el que:

un cultivo obtenido mediante el cultivo de E. coli transformada por uno cualquiera de un ADN que codifica la colagenasa de fusión y un vector de expresión que comprende el ADN se purifica mediante cromatografía por afinidad que corresponde a una marca de afinidad para recoger de ese modo de forma selectiva la colagenasa de fusión que tiene un dominio de unión a colágeno, en donde la colagenasa de fusión tiene las siguientes características (i) a (ii):

(i) la marca de afinidad se une directa o indirectamente a un extremo carboxilo de la colagenasa;

(ii) la colagenasa se selecciona entre los siguientes (a) a (h):

(a) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1 y 2;

(b) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1 y 2 en la que se suprimen, sustituyen, insertan o añaden de 1 a 30 aminoácidos;

(c) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de un 80 % o 20 superior con la secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1 y 2;

(d) una colagenasa en la que una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a -1 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1 y 2 se retira de una cualquiera de las colagenasas que se han descrito en (a) a (c);

(e) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 5 y 6;

(f) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 5 y 6 en la que se suprimen, sustituyen, insertan o añaden de 1 a 30 aminoácidos;

(g) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de un 80 % o superior con la secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 5 y 6;

(h) una colagenasa en la que una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a -1 de una cualquiera de las SEC ID Nº: 5 y 6 se retira de una cualquiera de las colagenasas que se han descrito en (e) a (g).

Colagenasa de fusión a la que se une una marca de afinidad, y método para producir la misma

Campo técnico La presente invención se refiere a una colagenasa usada para aislar células (masa celular) de un órgano, tales como células de los islotes pancreáticos de un páncreas.

Antecedentes de la técnica Como terapia para la curación para la diabetes, se ha conocido el trasplante de islotes pancreáticos, en el que los islotes pancreáticos (células que producen insulina) aislados de un páncreas tratado con una proteasa se trasplantan en la vena porta de un paciente diabético a través de goteo intravenoso. Este método de trasplante no requiere laparotomía para el paciente durante el transplante, y por lo tanto recientemente ha atraído la atención como una terapia de curación, que es segura y sencilla, para la diabetes.

Los islotes pancreáticos se aíslan de un páncreas mediante el tratamiento del páncreas con una colagenasa y una metaloproteasa neutra. Como la colagenasa usada para este fin, es particularmente eficaz una colagenasa derivada de Clostridium histolyticum (Bibliografías de No Patente 1, 2) .

Se ha averiguado que la colagenasa derivada de Clostridium histolyticum incluye dos tipos de enzimas que tienen diferente especificidad hacia el sustrato; colagenasa G y colagenasa H (Bibliografías de No Patente 1, 2) . Los genes que codifican la colagenasa G y la colagenasa H ya se han aislado, y se ha encontrado que ambas colagenasas son enzimas de dominios múltiples que incluyen un dominio catalítico en el lado del extremo amino y un dominio de unión a colágeno (en lo sucesivo en el presente documento, denominado "CBD") en el lado del extremo carboxilo (Bibliografías de No Patente 1, 2) .

Sin embargo, se ha encontrado el problema de que, cuando se produce una colagenasa con Clostridium

histolyticum, parte de la colagenasa expresada se degrada (Bibliografía de No Patente 2) , y el tratamiento de un páncreas con una colagenasa mezclada con la colagenasa degradada disminuye la calidad de los islotes pancreáticos aislados. Por lo tanto, para aislar los islotes pancreáticos, es deseable tratar un páncreas con una colagenasa obtenida retirando tal colagenasa degradada tanto como sea posible a partir del mismo.

Sin embargo, una colagenasa no degradada y una colagenasa degradada son similares en las propiedades fisicoquímicas, y por lo tanto ha sido difícil separar estas colagenasas con métodos tales como cromatografía de intercambio iónico o cromatografía hidrofóbica.

En tales antecedentes, se ha deseado un método para preparar una colagenasa por recogida selectiva de una 40 colagenasa no degradada a partir de colagenasas derivadas de Clostridium histolyticum.

Se debería indicar que aún no se ha informado la degradación de una colagenasa derivada de Clostridium histolyticum con la colagenasa siendo expresada como una proteína recombinante en un huésped tal como E. coli.

[Lista de citas]

[Bibliografías de no patente]

[NPL 1] Yoshihara, K. et. al. Journal of Bacteriology. (1994) , 176, 6489-6496 50 [NPL 2] Matsushita, O. et. al. Journal of Bacteriology. (1999) , 181, 923-933

Sumario de la invención BIOMOLECULAR NMR ASSIGNMENTS, vol. 2, nº 2, p. 127-129 desvela una proteína de fusión que comprende una 55 colagenasa de C. histolyticum y una marca de GST. El dominio de unión a colágeno C-terminal de la colagenasa está condensado con el extremo C de la marca de GST. APL MICROBIOL BIOTECHNOL (2008) 19: 627-635 describe una colagenasa de fusión en la que una marca de afinidad que contiene seis Histidinas se une a los extremos carboxilo de la colagenasa expresada en Clostridium perfringens.

Problema técnico La presente invención tiene como objetivo la recogida de forma selectiva de una colagenasa no degradada por retirada de una colagenasa degradada de colagenasas derivadas de Clostridium histolyticum.

Solución al problema Con respecto a las colagenasas derivadas de Clostridium histolyticum, los presentes inventores prepararon colagenasas de fusión en las que marcas de afinidad unidas a los extremos carboxilo de las colagenasas se 5 expresaban como proteínas recombinantes. Cuando una colagenasa derivada de Clostridium histolyticum se expresa como una proteína recombinante en un huésped tal como E. coli, no se ha predicho bien si la proteína recombinante se degrada por la acción de una proteasa en un huésped o no, ni cómo se degrada la proteína recombinante suponiendo que se degrade. Sin embargo, los presentes inventores purificaron la proteína de fusión expresada en un huésped con una columna de afinidad, y encontraron de forma accidental que se retiraba una 10 colagenasa degradada y que se recogía de forma selectiva una sola colagenasa que tenía una actividad de colagenasa. Esto se basa en las siguientes suposiciones: una colagenasa derivada de Clostridium histolyticum expresada en un huésped se degradó en el CBD en las cercanías de la marca de afinidad fusionada, y por lo tanto la degradación del CBD permitió que la marca de afinidad se separara de la colagenasa; y en la etapa de purificación por cromatografía por afinidad, la colagenasa degradada no se adsorbía a la columna de afinidad sino que solo se adsorbió una colagenasa no degradada a la columna de afinidad.

En otras palabras, los presentes inventores encontraron que si una marca de afinidad se une a una colagenasa en una configuración específica, una sola colagenasa que tiene una actividad de colagenasa se puede recoger de forma selectiva en el proceso de purificación por afinidad sin que se adsorba la colagenasa degradada en un huésped. Este descubrimiento ha llevado a los inventores a la finalización de la presente invención.

La presente invención se refiere a un método para producir una colagenasa de fusión, en el que:

un cultivo obtenido mediante el cultivo de E. coli transformada por uno cualquiera de un ADN que codifica la colagenasa de fusión y un vector de expresión que comprende el ADN se purifica mediante cromatografía por afinidad que corresponde a una marca de afinidad para recoger de ese modo de forma selectiva la colagenasa de fusión que tiene un dominio de unión a colágeno, en el que la colagenasa de fusión tiene las siguientes características (i) a (ii) :

(i) la marca de afinidad se une directa o indirectamente a un extremo carboxilo de la colagenasa;

(ii) la colagenasa se selecciona entre los siguientes (a) a (h) :

(a) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 1 y 2;

(b) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 1 y 2 en la que se suprimen, sustituyen, insertan, o añaden de 1 a 30 aminoácidos;

(c) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de un 80 % o superior con la secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID 40 Nº :1y2;

(d) una colagenasa en la que una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a -1 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 1 y 2 se retira de una cualquiera de las colagenasas que se han descrito en

(a) a (c) ;

(e) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una 45 cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6;

(f) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6 en la que se suprimen, sustituyen, insertan, o añaden de 1 a 30 aminoácidos;

(g) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de un 80 %

o superior con la secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6;

(h) una colagenasa en la que una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a -1 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6 se retira de una cualquiera de las colagenasas que se han descrito en (e) a (g) .

La colagenasa de fusión de acuerdo con la invención, en la que la marca de afinidad se une directa o indirectamente a un extremo carboxilo de la colagenasa.

La colagenasa de fusión de acuerdo con la invención, en la que la marca de afinidad es dos o más restos de histidina consecutivos.

La colagenasa de fusión de acuerdo con la invención, en la que la colagenasa se deriva de Clostridium histolyticum.

La colagenasa de fusión de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1021 de la SEC ID Nº : 3. En particular, a partir de la colagenasa de... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una colagenasa de fusión, en el que:

un cultivo obtenido mediante el cultivo de E. coli transformada por uno cualquiera de un ADN que codifica la colagenasa de fusión y un vector de expresión que comprende el ADN se purifica mediante cromatografía por afinidad que corresponde a una marca de afinidad para recoger de ese modo de forma selectiva la colagenasa de fusión que tiene un dominio de unión a colágeno, en donde la colagenasa de fusión tiene las siguientes características (i) a (ii) :

(i) la marca de afinidad se une directa o indirectamente a un extremo carboxilo de la colagenasa;

(ii) la colagenasa se selecciona entre los siguientes (a) a (h) :

(a) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 1 y 2;

(b) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 1 y 2 en la que se suprimen, sustituyen, insertan o añaden de 1 a 30 aminoácidos;

(c) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de un 80 % o superior con la secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1008 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 1 y 2;

(d) una colagenasa en la que una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a -1 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 1 y 2 se retira de una cualquiera de las colagenasas que se han descrito en

(a) a (c) ;

(e) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6;

(f) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6 en la que se suprimen, sustituyen, insertan o añaden de 1 a 30 aminoácidos;

(g) una colagenasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de un 80 %

o superior con la secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 981 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6;

(h) una colagenasa en la que una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a -1 de una cualquiera de las SEC ID Nº : 5 y 6 se retira de una cualquiera de las colagenasas que se han descrito en (e) a (g) .

2. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la colagenasa de fusión es una colagenasa de fusión en la que la marca de afinidad es dos o más restos de histidina consecutivos.

3. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la colagenasa de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a 1021 de la SEC ID Nº : 3.

4. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la colagenasa de fusión es una colagenasa de fusión a partir de la que se retira una secuencia de aminoácidos de las posiciones -110 a -1 de la SEC ID Nº : 3.

5. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la colagenasa de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a 994 de la SEC ID Nº : 7.

6. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la colagenasa de fusión es una colagenasa de fusión a partir de la que se retira una secuencia de aminoácidos de las posiciones -40 a -1 de la SEC ID Nº : 7.

7. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ADN que codifica la colagenasa de fusión es un ADN que comprende una secuencia de bases de las posiciones 1 a 3396 de la SEC ID Nº : 4.

8. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ADN que codifica la colagenasa de fusión es un ADN que comprende una secuencia de bases de las posiciones 1 a 3105 de la SEC ID Nº : 8.