Cepa de hongo Hormonema sp. CECT 13092 y procedimiento de aplicación para la deslignificación de biomasa lignocelulósica.

Cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092,

que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 y procedimiento de deslignificación de biomasa lignocelulósica, en el que se aplica a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo depositada con el número de depósito CECT 13092 o un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo depositada con el número de depósito CECT 13092. En dicho procedimiento, se biopulpea la biomasa realizando un pasteado kraft, se bioblanquea realizando un blanqueo con peróxido de hidrógeno o se utiliza la biomasa deslignificada para producir bioetanol.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención está relacionado de forma general con la industria de la celulosa y la fabricación de papel. Específicamente, en la presente invención se describe una cepa de hongo eficaz en diferentes aplicaciones relacionadas con la industria de la celulosa, concretamente en los procesos de biopulpeo, bioblanqueo y producción de bioetanol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los hongos endófitos habitan los tejidos asintomáticos de las plantas, viviendo en simbiosis con sus hospedantes. Estos hongos representan una elevada diversidad fúngica de magnitud desconocida. Esto les convierte en fuentes potenciales de herramientas biotecnológicas para múltiples usos.

Tras la muerte de la planta o de alguno de sus órganos, ciertos endófitos pasan de un estado de latencia a otro de colonizadores primarios dominantes en la descomposición de los tejidos. La posterior aparición de hongos saprófitos secundarios que colonizan el sustrato conduce frecuentemente a la desaparición de los endófitos, que parecen tener diferentes habilidades degradadoras que los anteriores. Los mecanismos de degradación de la madera por los hongos endófitos no están claros, aunque se piensa que existe una alta diversidad en la forma que diferentes endófitos degradan a sus hospedantes y sus sustratos.

Los hongos saprófitos secundarios han sido ampliamente investigados como herramientas biotecnológicas para mejorar procesos y disminuir contaminantes en la industria de la celulosa y en la producción de bioetanol. Aunque su uso ha mostrado ciertos beneficios, su aplicación a escala industrial no está aún optimizada en la mayoría de los casos. En este sentido, la cepa de hongo endófito descrita en la presente invención ha demostrado tener una capacidad deslignificante superior a un saprófito de referencia (Trametes sp I-62) en el caso del biopulpeo.

La actividad altamente específica de los hongos endófitos, como degradadores primarios de materiales lignocelulósicos a los que están adaptados por procesos evolutivos, podría facilitar la posterior actuación degradadora de los saprófitos secundarios. Por ello, es esperable que su aplicación tecnológica en los procesos industriales como etapa previa o en combinación con saprófitos secundarios, mejore los rendimientos actualmente obtenidos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La realización preferida de la invención consiste en una cepa de hongo Hormonema sp depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, en adelante cepa de la invención.

La cepa CECT 13092 ha sido depositada el 16 de octubre de 2013 en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con dirección en Parc Científic Universitat de València, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia, España) , por la Universidad Politécnica de Madrid, con dirección en Ramiro de Maeztu, 7, 28040, Madrid (España) .

La cepa CECT 13092 ha sido identificada por el depositante mediante la referencia AS3-R3, y recibió el número de depósito CECT 13092 por la autoridad internacional de depósito. En la presente solicitud, se hace referencia a la cepa CECT 13092 mediante los términos “cepa CECT 13092”, “AS3-R3” o “AS3R3”.

La cepa CECT 13092 es un hongo endófito aislado a partir de una rama de eucalipto (Eucalyptus globulus Labill.) recogida en el concejo de Llanes (Asturias) en septiembre de 2012. El aislamiento inicial se realizó utilizando como medio de cultivo rosa de bengala y cloranfenicol, agar. Posteriormente se repicó a extracto de malta, agar.

La clasificación taxonómica de la cepa de hongo endófito CECT 13092 se realizó mediante sus características morfológicas y mediante la secuenciación de su ADN.

Morfológicamente se trata de un hongo que en extracto de malta-agar crece inicialmente con un color blanquecino o amarillento y posteriormente adquiere una tonalidad oscura, casi negra, y un aspecto ceroso. La colonia combina zonas en las que el hongo crece predominantemente en forma de hifa y otras donde crece en forma de levadura. Las colonias crecen lentamente, alcanzando los 2 cm de diámetro trascurridos 15-20 días. Las hifas son densamente septadas y los conidios son hialinos, sin septos, usualmente elipsoidales y de tamaño heterogéneo, siendo el rango más habitual 5-7 x 2, 5-3, 5 µm. No se observó la presencia de conidióforos. Las células conidiógenas de las hifas normalmente no se diferencian de las que componen el resto del micelio. Los conidios se suelen observar en proceso de gemación, originando uno o dos conidios secundarios que se acumulan en masas de aspecto de levadura.

Atendiendo a la morfología de la colonia, la cepa se puede clasificar como perteneciente al grupo de hongos dematiáceos conocido como levaduras negras, miembros imperfectos de los Dothideales (Ascomicetos) . Este grupo incluye diferentes géneros y especies de hongos que son difíciles de clasificar e identificar por métodos microscópicos.

Se aisló el ADN nuclear, posteriormente se amplificó y se secuenció la región ITS (del inglés Internal Transcribed Spacers) del hongo. La secuencia parcial de la región ITS1 del hongo es la SEQ ID NO: 1 y la secuencia completa de la region ITS2 del hongo es la SEQ ID NO:

2. Tras comparar esta secuencia con las existentes en Genebank usando el programa Blast, la secuencia identificada con mayor similitud corresponde a Dothideomycetes, y como especie Hormonema sp. (identities: 98%; gaps: 0%) . La secuencia del hongo no apareció cercana a la de dos especies del género Hormonema frecuentes en la Península Ibérica, como son H. carpetanum y H. dematioides.

Otra realización preferida es un procedimiento de deslignificación de biomasa lignocelulósica, donde se aplica a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 o un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, en adelante procedimiento de la invención.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha biomasa lignocelulósica se biopulpea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 y realizando un pasteado kraft. De forma particular, el procedimiento de la invención comprende incubar dicha cepa con dicha biomasa lignocelulósica entre 18 y 38 días a una temperatura entre 18 y 28 ºC.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha biomasa lignocelulósica se bioblanquea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, y realizando un blanqueo con peróxido de hidrógeno.

Otra realización es el procedimiento de la invención, que comprende:

(a) aplicar dicha cepa a dicha biomasa lignocelulósica, y

(b) utilizar la biomasa resultante de la etapa (a) para producir bioetanol.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha biomasa lignocelulósica es de olmo, álamo, chopo, eucalipto, pino, picea, paja de trigo, paja de cebada, poda de naranjo, poda de olivo y/o Hesperaloe funifera.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS

A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias.

SEQ ID NO: 1. ITS1 de Hormonema sp. CECT 13092; secuencia parcial. SEQ ID NO: 2. ITS2 de Hormonema sp. CECT 13092; secuencia completa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Producción de actividad lacasa de la cepa CECT 13092 en medio 7 Czapek-Dox modificado en presencia de CuSO4 0, 30 mM y 1% de etanol.

Figura 2. Actividad enzimática del crudo de la cepa CECT 13092 medida con ABTS a distintos pHs.

Figura 3. Actividad enzimática residual del crudo incubado a distintos pHs y temperatura de 40 y 50ºC a lo largo del tiempo. pH=2 y 40 ºC (círculos negros) , pH=3 y 40 ºC (círculos blancos) , pH=4 y 40 ºC (triángulos negros) , pH=2 y 50 ºC (triángulos blancos) , pH=3 y 50 ºC (cuadrados negros) y pH=4 y 50 ºC (cuadrados blancos) .

Figura 4. Número kappa obtenidos tras los procesos de biopulpeo ensayados con el hongo endófito seleccionado y secuencias de hongos.

Figura 5. Blancura (%ISO) obtenidas tras los procesos de biopulpeo ensayados con el hongo endófito seleccionado y secuencias...

1. Cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2.

2. Procedimiento de deslignificación de biomasa lignocelulósica, caracterizado por que se aplica a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 o un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha biomasa lignocelulósica se biopulpea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 y realizando un pasteado kraft.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que comprende incubar dicha cepa con dicha biomasa lignocelulósica entre 18 y 38 días a una temperatura entre 18 y 28 ºC.

5. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha biomasa lignocelulósica se bioblanquea aplicando a dicha biomasa lignocelulósica un crudo enzimático aislado de una cepa de hongo Hormonema sp. depositada con el número de depósito CECT 13092, que comprende las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2, y realizando un blanqueo con peróxido de hidrógeno.

6. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende:

(a) aplicar dicha cepa a dicha biomasa lignocelulósica, y

(b) utilizar la biomasa resultante de la etapa (a) para producir bioetanol.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado por que dicha biomasa lignocelulósica es de olmo, álamo, chopo, eucalipto, pino, picea, paja de trigo, paja de cebada, poda de naranjo, poda de olivo y/o Hesperaloe funifera.

AS3R3

0, 30 0, 25 0, 20 0, 15

0, 00

5 101520253035 Díasºdeºcultivo Fig.º1

100 80 60 40 20

02468 pH Fig.º2

Actividad lacasa (%)

100

Actividad enzimática

residual (%)

60 40 20 0

Tiempoº (h)

Fig.º3

Fig.º4

Fig.º5

Fig.º6

Fig.º7

P6766-2013 seq listing.txt SEQUENCE LISTING

<110> UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA AGRARIA Y ALIMENTARIA (INIA)

<120> CEPA DE HONGO Hormonema sp. CECT 13092 Y PROCEDIMIENTO DE APLICACIÓN PARA LA DESLIGNIFICACIÓN DE BIOMASA LIGNOCELULÓSICA

<160> 2

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 167

<212> DNA

<213> Hormonema <220>

<221> source <222> 1..167

<223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Hormonema sp. CECT 13092 ITS1 (Internal Transcribed Spacer

1) ; partial sequence." /organism="Hormonema"

<400> 1 tcccgcaacc tcaacccttt gttgttataa ctaccttgtt gctttggcgt ggaccgttcg 60

gttcgccgaa ctgccagggc ccttcggggt cgcggtaagt gcccgccaga gtcaaaccaa 120

actcttgttt ttaaccggtc gtctgagtac aagtttaaat taaatta 167

<210> 2

<211> 162

<212> DNA

<213> Hormonema <220>

<221> source <222> 1..162

<223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Hormonema sp. CECT 13092 ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2) ; complete sequence." /organism="Hormonema"

<400> 2 caccactcaa gctctgcttg gtattaggca ttcgtcctcc tcacggtggg cgtgcctcaa 60

aaatctcggc ggagcctttc cggctttggg cgtagtagaa tttctaatca cgtctttaaa 120

cggagaggtt tccattgccg ctaaaccttt tatttttaca gg 162