Caracterización de equipos de cromatografía.

Método para determinar si un relleno reutilizable de columna cromatográfica,

que se utiliza una por lo menos segunda vez en una etapa de purificación de una purificación de un polipéptido, presenta una eficacia de separación reducida en dicha etapa de purificación de dicha purificación de dicho polipéptido, caracterizado por que dicho método comprende las etapas siguientes:

a) identificar y determinar los datos experimentales de un cambio inercial de por lo menos un parámetro físicoquímico de una fase móvil que pasa por dicho relleno reutilizable de columna cromatográfica del por lo menos segundo uso,

b) determinar los parámetros de una función de fórmula I mediante el ajuste de los datos experimentales del cambio inercial del parámetro físicoquímico del por lo menos segundo uso,

c) determinar la diferencia entre los datos experimentales del cambio inercial del parámetro físicoquímico del por lo menos segundo uso y la función de fórmula I con los parámetros determinados en la etapa b),

d) calcular la diferencia entre el valor máximo y el valor mínimo de la diferencia determinada en la etapa

c) y normalizar dicha diferencia, e) determinar la eficacia de separación reducida de dicho relleno reutilizable de columna cromatográfica en el caso de que el valor absoluto de la diferencia calculada en la etapa d) sea superior a 0,1, en el que la función de fórmula I es:**Fórmula**

con valores absolutos de la señal determinados por el solvente utilizado (A e y0), el valor medio y la desviación estándar de la función de distribución gaussiana subyacente (xc, w) y la constante de tiempo de la función de caída exponencial subyacente (t0), y

en el que la función erf utilizada se define como:**fórmula**

Caracterización de equipos de cromatografía

El método informado en la presente memoria se encuentra comprendido en el campo de la cromatografía, especialmente en el campo de la cromatografía de columna preparativa. En la presente memoria se informa de un método para la determinación directa de la calidad del relleno de una columna de cromatografía basada en datos de proceso. Con este método puede conseguirse un ahorro de tiempo y recursos de proceso ya que puede eliminarse una adquisición de datos adicional para la determinación de la integridad de la columna.

Antecedentes de la invención

Actualmente la práctica totalidad de los polipéptidos utilizados en los medicamentos se preparan recombinantemente. Debido a las estrictas directrices y requisitos normativos, deben eliminarse al máximo los productos secundarios de la preparación de polipéptidos terapéuticos. Por lo tanto, se utiliza por lo menos una etapa de cromatografía en el procesamiento posterior del polipéptido en bruto tras la producción recombinante. Debido a que las dimensiones de los equipos cromatográficos con respecto al rendimiento del procedimiento de fermentación, especialmente la capacidad de separación de las columnas cromatográficas, son limitadas, debe procesarse una multitud de lotes para poder obtener la cantidad necesaria de polipéptido terapéutico purificado.

Para garantizar que cada lote del polipéptido terapéutico purificado presenta el mismo efecto farmacéutico, para cada lote debe cumplirse una lista de parámetros analíticos. Lo anterior solo puede conseguirse en el caso de que las etapas del procedimiento de purificación operen de manera consistente y eficiente. Sin embargo, en el caso de que una etapa del procedimiento de purificación no funcione correctamente, el producto obtenido con toda probabilidad no pasará las pruebas analíticas y, en el peor de los casos, no podrá utilizarse el lote. Por lo tanto, resulta necesario proporcionar métodos para determinar el rendimiento y la eficacia de las etapas de purificación.

Teeters M.A. y Quinones-Garcia I. (J. Chrom. A 169:53-64, 25) informan de la evaluación y el seguimiento del comportamiento de empaquetamiento de columnas cromatográficas a escala de proceso mediante la utilización de las respuestas a entradas de pulso y paso basadas en la conductividad, derivadas de experimentos con trazadores y transiciones dentro del procedimiento, especialmente a partir de distribuciones de tiempos de residencia medidos. Norling et al. (Norling, L., et al., J. Chrom. A 169:79-89, 25) informan del impacto de la reutilización múltiple de medios de cromatografía de intercambio aniónico sobre la eliminación de virus. La utilización de datos del procedimiento para evaluar el rendimiento cromatográfico en las columnas de purificación de proteínas de escala productiva se informa en Larson et al. (Larson, T.M., et al., Biotechnol. Prog. 19:485-492, 23). Moscariello J. et al., J. Chrom. A 98:131-141, 21, informan de la caracterización del rendimiento de columnas de escala industrial mediante la utilización de un modelo Gaussiano de tiempo modificado. Se informa de la resolución y eficiencia de la columna en cromatografía en Vink H., J. Chrom. 69:237-242, 1972. Sarker M. y Guiochon G., J. Chrom. A 72:27-44, 1995, informan de un estudio del comportamiento de empaquetamiento de columnas de compresión axial para cromatografía preparativa.

La utilización de una forma integrada de la función de distribución gaussiana permite la descripción de las características del lecho empaquetado, mientras que omite los efectos externos al lecho empaquetado mismo, que influyen potencialmente sobre la evaluación (ver, por ejemplo, el documento n° PCT/EP21/3813). La ¡mplementación de las característicos de los equipos en la evaluación de las distribuciones no gaussianas observadas durante la evaluación de los lechos cromatográficos empaquetados ha sido descrita por Guiochon G. et al. (Fundamentáis of preparative and nonlinear chromatography, Guiochon G. et al. (editores), Elsevier Inc., San Diego (USA), 2a edición, 26).

En el documento n° WO 98/46623, se informa de la purificación de péptidos y oligonucleótidos mediante un procedimiento y aparato de cromatografía por desplazamiento de las muestras. Los métodos de optimización de la separación cromatográfica de los polipéptidos se informan en el documento n° WO 28/28974. En el documento n° WO 21/19814 se informa de métodos para evaluar el rendimiento de la columna cromatográfica.

Descripción resumida de la invención

Con el método informado en la presente memoria puede realizarse una determinación de la reducción de la eficacia de separación y/o de la calidad del relleno reutilizable de una columna cromatográfica sin necesidad de utilizar e inyectar un compuesto trazador adicional antes de la separación de la solución de polipéptido en bruto, con el fin de determinar la integridad del material cromatográfico o la necesidad de datos históricos de esta etapa de purificación.

El método informado en la presente memoria permite determinar separadamente parámetros de la matriz de relleno de manera independiente de las contribuciones y efectos de los equipos implicados. Lo anterior permite discriminar

y/o asignar efectos físicos separados y una caracterización completa de los equipos cromatográficos utilizados con independencia de la escala, tal como a escala analítica y a escala industrial. El primer aspecto informado en la presente memoria es un método para determinar si un relleno reutilizable de columna cromatográfica que se utiliza por lo menos una segunda vez en una etapa de purificación de un procedimiento de purificación multietapa de un polipéptido, presenta una eficacia de separación reducida, por ejemplo en comparación con la eficacia de separación en el caso de que se utilice por primera vez en la misma etapa de purificación del mismo procedimiento de purificación multietapa del mismo polipéptido, comprendiendo las etapas siguientes:

a) identificar y determinar los datos experimentales de un cambio inercial de por lo menos un parámetro fisicoquímico de una fase móvil que pasa por dicho relleno reutilizable de columna cromatográfica, b) determinar los parámetros de una función de fórmula I mediante el ajuste de los datos experimentales del cambio inercial del parámetro fisicoquímico del por lo menos segundo uso determinado en la etapa a),

c) determinar la diferencia entre los datos experimentales del cambio inercial del parámetro fisicoquímico del por lo menos segundo uso determinado en la etapa a) y la función de fórmula I con los parámetros determinados en la etapa b), d) calcular la diferencia entre el valor máximo y el valor mínimo de la diferencia determinada en la etapa c) y normalizar dicha diferencia, e) determinar la eficacia de separación reducida de dicho relleno reutilizable de columna reutilizable al calcular que el valor absoluto de la diferencia en la etapa d) es superior a ,1,

en el que la función de fórmula I es:

fórmula I

en la que los parámetros A e y describen los cambios de señal respectivos, xc es el valor medio y w es la desviación estándar de la función de distribución gaussiana subyacente, respectivamente, y el parámetro to, que describe la constante de tiempo de la función de caída exponencial subyacente, y en la que la función erf utilizada se define

como:

, 2

(2« + l)«! '

Otro aspecto informado en la presente memoria es un método para la purificación cromatográfica de un polipéptido, en la que se encuentra comprendida por lo menos una etapa cromatográfica con un relleno reutilizable de columna cromatográfica, que comprende las etapas siguientes:

a) identificar y determinar los datos experimentales de un cambio inercial de por lo menos un parámetro fisicoquímico de una fase móvil que pasa por dicho relleno reutilizable de columna cromatográfica, b) determinar los parámetros de una función de fórmula I mediante el ajuste de los datos experimentales del cambio inercial del parámetro fisicoquímico del por lo menos segundo uso,

c) determinar la diferencia entre los datos experimentales del cambio inercial del parámetro fisicoquímico del por lo menos segundo uso y la función de fórmula I con los parámetros determinados en la etapa b),

d) calcular la diferencia entre el valor máximo y el valor mínimo de la diferencia determinada en la etapa c) y normalizar dicha diferencia, en la que la función de fórmula I es:

fórmula I

en la que los parámetros A e yo describen los cambios de señal respectivos, xc es el valor medio y w es la desviación estándar de la función de distribución gaussiana subyacente,... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar si un relleno reutilizable de columna cromatográfica, que se utiliza una por lo menos segunda vez en una etapa de purificación de una purificación de un polipéptido, presenta una eficacia de separación reducida en dicha etapa de purificación de dicha purificación de dicho polipéptido, caracterizado por que dicho método comprende las etapas siguientes:

a) identificar y determinar los datos experimentales de un cambio inercial de por lo menos un parámetro físicoquímico de una fase móvil que pasa por dicho relleno reutilizable de columna cromatográfica del por lo menos segundo uso,

b) determinar los parámetros de una función de fórmula I mediante el ajuste de los datos experimentales del cambio inercial del parámetro físicoquímico del por lo menos segundo uso,

c) determinar la diferencia entre los datos experimentales del cambio inercial del parámetro físicoquímico del por lo menos segundo uso y la función de fórmula I con los parámetros determinados

en la etapa b),

d) calcular la diferencia entre el valor máximo y el valor mínimo de la diferencia determinada en la etapa

c) y normalizar dicha diferencia, e) determinar la eficacia de separación reducida de dicho relleno reutilizable de columna cromatográfica en el caso de que el valor absoluto de la diferencia calculada en la etapa d) sea superior a ,1, en el que la función de fórmula I es:

fórmula I

con valores absolutos de la señal determinados por el solvente utilizado (A e yo), el valor medio y la desviación estándar de la función de distribución gaussiana subyacente (xc, w) y la constante de tiempo de la función de caída exponencial subyacente (to), y en el que la función erf utilizada se define como:

; (a«+i>rf-

2.Método para la purificación cromatográfica de un polipéptido, en el que se encuentra contenido por lo menos una etapa cromatográfica utilizando un relleno reutilizable de columna cromatográfica, caracterizado por que dicho método comprende las etapas siguientes:

a) identificar y determinar los datos experimentales de un cambio inercial de por lo menos un parámetro físicoquímico de una fase móvil que pasa por dicho relleno reutilizable de columna cromatográfica del por lo menos segundo uso,b) determinar los parámetros de una función de fórmula I mediante el ajuste de los datos experimentales del camibo inercial del parámetro físicoquímico del por lo menos segundo uso, c) determinar la diferencia entre los datos experimentales del cambio inercial del parámetro físicoquímico del por lo menos segundo uso y la función de fórmula I con los parámetros determinados en la etapa b), d) calcular la diferencia entre el valor máximo y el valor mínimo de la diferencia determinada en la etapa c) y normalizar dicha diferencia, en el que la función de fórmula I es:

fórmula I

con valores absolutos de la señal determinados por el solvente utilizado (A e yo), el valor medio y la desviación estándar de la función de distribución gausslana subyacente (xc, w) y la constante de tiempo de la función de caída exponencial subyacente (to), y en el que la función erf utilizada se define como:

- además la utilización del relleno reutilizable de columna cromatográflca en el caso de que el valor absoluto de la diferencia calculada en la etapa d) sea de ,6 ó inferior, o

- llevar a cabo una caracterización y/o evaluación adicional del pollpéptldo purificado en el caso de que el valor absoluto de la diferencia calculada en la etapa d) sea superior a ,6 aunque inferior a ,2, o

- modificar el relleno reutilizable de columna cromatográflca en el caso de que el valor absoluto de la diferencia calculada en la etapa d) sea de ,2 ó superior.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que dicho cambio inercial de por lo menos un parámetro físicoquímico de una fase móvil que pasa por dicho relleno reutilizable de columna cromatográflca es un cambio producido por el cambio de la concentración de una sustancia en la fase móvil que no interactúa con el relleno reutilizable de la columna.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho cambio inercial es un cambio de conductividad o de adsorción a 28 nm.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho cambio inercial de por lo menos un parámetro físicoquímico de una fase móvil que pasa por dicho relleno reutilizable de columna cromatográflca es un cambio de 1% de una solución que contiene un agente desnaturalizante a 1% de una solución que no contiene dicho agente desnaturalizante, o viceversa.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho agente desnaturalizante se selecciona de entre hidróxido sódico, cloruro de guanidinio, urea o solvente orgánico.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho cambio inercial es un cambio sigmoldal.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho cambio inercial es un cambio durante el tiempo.

y