Aptámeros estabilizados para factor de crecimiento derivado de plaquetas y su uso como productos terapéuticos oncológicos.

Uso de un aptámero que se une con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer en un paciente,

en donde el aptámero comprende una estructura de secuencia de nucleótidos: **Fórmula**

en las que d ≥ desoxi, m ≥ 2'-O-metilo, PEG ≥ polietilenglicol.

Aptámeros estabilizados para factor de crecimiento derivado de plaquetas y su uso como productos terapéuticos oncológicos

Campo de la invención

La invención se refiere en general al campo de los ácidos nucleicos y más particularmente a aptámeros capaces de unirse con el factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGF") útiles como productos terapéuticos en oncología y/u otras enfermedades o trastornos en los que se ha implicado al PDGF. La invención se refiere además a materiales y métodos para la administración de aptámeros capaces de unirse con el factor de crecimiento derivado de plaquetas.

Antecedentes de la invención

Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que tienen afinidad de unión específica con moléculas mediante interacciones distintas de la formación de pares de bases de Watson-Crick clásica.

Los aptámeros, como los péptidos generados por presentación de fagos o anticuerpos monoclonales (MAb), son capaces de unirse específicamente con dianas seleccionadas y, mediante la unión, bloquear la capacidad de sus dianas para actuar. Creados por un proceso de selección in vitro de grupos de oligonucleótidos de secuencia aleatoria (Figura 1), se han generado aptámeros para más de 1 proteínas incluyendo factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas y receptores. Un aptámero típico es de 1-15 kDa de tamaño (3-45 nucleótidos), se une con su diana con afinidad subnanomolar, y diferencia frente a dianas estrechamente relacionadas (por ejemplo, normalmente no se unirán con otras proteínas de la misma familia génica). Varios estudios estructurales han mostrado que los aptámeros son capaces de usar los mismos tipos de interacciones de unión (enlaces de hidrógeno, complementariedad electrostática, contactos hidrófobos, exclusión estérica, etc.) que conducen la afinidad y especificidad en complejos de anticuerpo-antígeno.

Los aptámeros tienen varias características deseables para su uso como productos terapéuticos (y de diagnóstico) incluyendo alta especificidad y afinidad, eficacia biológica y excelentes propiedades farmacocinéticas. Además, ofrecen ventajas competitivas específicas frente a anticuerpos y otros productos biológicos proteicos, por ejemplo:

11 Velocidad v control. Se producen aptámeros por un proceso completamente in vitro, permitiendo la rápida generación de candidatos iniciales (terapéuticos). La selección in vitro permite que la especificidad y afinidad del aptámero estén estrechamente controladas y permite la generación de candidatos frente a dianas tanto tóxicas como no inmunogénicas.

21 Toxicidad e inmunoaenicidad. Los aptámeros como clase han demostrado poca o ninguna toxicidad o inmunogenicidad. En dosificación crónica de ratas o marmotas con altos niveles de aptámero (1 mg/kg diario durante 9 días), no se observa toxicidad por ninguna medida clínica, celular o bioquímica. Mientras que la eficacia de muchos anticuerpos monoclonales puede limitarse gravemente por la respuesta inmunitaria a los anticuerpos en sí mismos, es extremadamente difícil inducir anticuerpos para aptámeros (más probablemente porque los aptámeros no pueden presentarse por linfocitos T mediante el MHC y la respuesta inmunitaria se entrena en general para no reconocer fragmentos de ácido nucleico).

31 Administración. Mientras que todos los productos terapéuticos de anticuerpo aprobados en la actualidad se administran por infusión intravenosa (normalmente durante 2-4 horas), los aptámeros pueden administrarse por inyección subcutánea. Esta diferencia se debe principalmente a la solubilidad comparativamente baja y por lo tanto grandes volúmenes necesarios para la mayoría de los MAb terapéuticos. Con buena solubilidad (>15 mg/ml) y peso molecular comparativamente bajo (aptámero: 1-5 kDa; anticuerpo: 15 kDa), puede suministrarse una dosis semanal de aptámero por inyección en un volumen de menos de ,5 mi. La biodisponibilidad de aptámeros mediante administración subcutánea es mayor > 8 % en estudios de monos (Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 23- 212, 1999). Además, el pequeño tamaño de los aptámeros les permite penetrar en áreas de constricciones conformacionales que no permiten que penetren anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, presentando otra ventaja más de los productos terapéuticos o profilaxis basados en aptámeros.

41 Cambio de escala v coste. Los aptámeros terapéuticos se sintetizan químicamente y en consecuencia pueden aumentarse de escala fácilmente según sea necesario para cumplir la demanda de la producción. Mientras que las dificultades en el cambio de escala de la producción limitan en la actualidad la disponibilidad de algunos productos biológicos y el coste de capital de una planta de producción de proteínas a gran escala es enorme, un único sintetizador a gran escala puede producir más de 1 kg de oligonucleótido al año y requiere una inversión inicial relativamente modesta. El coste actual de los productos para síntesis de aptámeros en la escala de kilogramos se estima en 5 $/g, comparable al de anticuerpos altamente optimizados. Se espera que mejoras continuadas en el desarrollo del proceso reduzcan el coste de los productos a < 1 $/g en cinco años.

51 Estabilidad. Los aptámeros terapéuticos son químicamente robustos. Están adaptados de forma intrínseca para recuperar la actividad después de exposición al calor, desnaturalizantes, etc. y pueden almacenarse durante periodos prolongados (> 1 año) a temperatura ambiente como polvos liofilizados. Por el contrario, los anticuerpos deben almacenarse refrigerados.

Presión de líquido intersticial

Los tres tipos más comunes de tratamiento de cáncer son retirada quirúrgica del tejido canceroso, radioterapia para destruir el tejido canceroso y quimioterapia. Estos tratamientos se dirigen a la retirada de los tejidos o células cancerosas o su destrucción en el cuerpo con productos terapéuticos u otros agentes. La quimioterapia sigue siendo una modalidad de tratamiento importante para tumores sólidos. Para reducir potencialmente los efectos secundarios tóxicos y conseguir mayor eficacia de los fármacos quimioterapéuticos, son altamente deseables estrategias para mejorar la distribución de fármacos entre tejidos normales y tumores.

Un obstáculo importante en el tratamiento de tumores sólidos es la captación limitada de agentes terapéuticos en tejido tumoral. La presión de líquido intersticial elevada ("IFP") es una de las propiedades fisiológicamente distintivas de los tumores sólidos que difieren del tejido conectivo sano y se considera que es el principal obstáculo que limita la difusión libre de productos terapéuticos en tumores sólidos. Se han implicado los receptores de PDGF, particularmente PDGF-(3, en la regulación de la IFP. A medida que un tumor entra en un estado hiperprollferatlvo, la sangre que aporta oxígeno y otros nutrientes no puede cumplir los requisitos de los tumores y se produce un estado de hipoxia. La hlpoxla desencadena un "cambio anglogénlco" que regulará positivamente la expresión de varios factores incluyendo VEGF y PDGF que a su vez actúan para ¡nielar la angiogénesis. Sin embargo, la angiogénesis que resulta forma una vasculatura tumoral anómala. La vasculatura tumoral se altera hasta el punto de ser incapaz de drenar adecuadamente el exceso de líquido del intersticio y la acumulación de líquido dilata la matriz intersticial elástica provocando el aumento de la presión. Cuando la presión excede la resistencia de la pared capilar, se produce compresión y aumenta la resistencia del flujo sanguíneo.

Esta propiedad de la mayoría de los tumores sólidos, hipertensión intersticial tumoral o IFP aumentada, se ha sugerido como una diana potencial para intentos de aumentar la captación farmacológica del tumor (Jain ef al., (1987) Cáncer Res., 47: 339-351). La IFP aumentada actúa como una barrera para el transporte transvascular tumoral (Jain ef al. (1997), Adv. Drug Deliv. Rev. 26: 71-9). Se ha mostrado que la reducción de la IFP tumoral, o modulación de la presión microvascular, aumenta el transporte transvascular de anticuerpos que se dirigen a tumores o compuestos indicadores de bajo peso molecular (Pietras ef al., (21), Cáncer Res., 61, 2929-2934). La etiología de la hipertensión intersticial en tumores no se entiende bien. Una teoría propuesta es que la falta de vasos linfáticos en tumores es un factor que contribuye a la IFP tumoral aumentada (Jain et al., (1987), Cáncer Res., 47: 339-351). Otra teoría propuesta es que la microvasculatura y el compartimento de estroma de apoyo probablemente sean determinantes importantes para la IFP tumoral (Pietras et al., (22) Cáncer Res., 62: 5476- 5484). Las pruebas... [Seguir leyendo]

1. Uso de un aptámero que se une con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer en un paciente, en donde el aptámero comprende una 5 estructura de secuencia de nucleótidos:

cJCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG'dCdGcITclAmQdAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTmCdCdTmGmGmG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID ND: 4-PEG-SEC ID N°: 7),

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTdCdGdTmGmGmG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 71),

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGíiAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTdCdCdTdGdGdG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 72); o

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTmCdCdTdGdGdG (SEC ID NP: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°:73)

en las que d = desoxi, m = 2--metilo, PEG = polietilenglicol.

2. Un aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer en un paciente, en donde el aptámero comprende

una estructura de secuencia de nucleótidos:

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTmCdCdTmGmGmG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 7),

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTdCdCdTmGmGmG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 71),

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTdCdCdTdGdGdG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC IDN°:72);o

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG- dTdGdAdTmCdCdTdGdGdG (SEC ID NP: 69-PEG-SEC IDN°: 4-PEG-SEC IDN°:73)

en las que d = desoxi, m = 2--metilo, PEG = polietilenglicol.

3. El uso de la reivindicación 1 o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 2 en

el que el tratamiento de cáncer implica:

- inhibir el crecimiento de un tumor;

- reducir la presión de líquido intersticial en un tumor sólido;

- aumentar la permeabilidad de un tumor sólido a un agente citotóxico;

- reducir la expresión constitutiva del factor de crecimiento derivado de plaquetas en un tumor; o

- reducir la angiogénesis y la neovascularización en un tumor sólido.

4. Un aptámero que se une con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) comprendiendo el aptámero 35 una estructura de secuencia de nucleótidos:

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG-dTdGdAdTmCdCdTmGmGmG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 7),

dCdCdCdAdGdGdCdT dAdCmG-PEG-dCdGdT dAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG-dT dGdAdT dCdCdT mGmGmG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 71),

dCdCdCdAdGdGdCdT dAdCmG-PEG-dCdGdT dAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG-dT dGdAdT dCdCdTdGdGdG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 72), o

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmllmCmA-PEG-dTdGdAdTmCdCdTdGdGdG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 73)

en las que d = desoxl, m = 2--metilo, PEG = polletllenglicol.

5. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 comprendiendo el aptámero la estructura de secuencia de nucleótidos:

dCdCdCdAdGdGdCdTdAdCmG-PEG-dCdGdTdAmGdAmGdCdAmUmCmA-PEG-dTdGdAdTmCdCdTmGmGmG (SEC ID N°: 69-PEG-SEC ID N°: 4-PEG-SEC ID N°: 7)

en la que d = desoxl, m = 2--metilo, PEG = polietilengllcol.

6. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores comprendiendo el aptámero un resto de recubrimiento.

7. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 6 comprendiendo el aptámero un recubrimiento de desoxitimidina invertido 3.

8. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores estando conjugado el aptámero con un polímero de alto peso molecular.

9. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 8 en el que el polímero de alto peso moleculares polietilenglicol.

1. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores estando conjugado el aptámero en su extremo 5 con un polietilenglicol de alto peso molecular.

11. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el polietilenglicol de alto peso moleculares un polietilenglicol de 2 kDa.

12. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el polietilenglicol de alto peso molecular es un polietilenglicol de 3 kDa.

13. Un aptámero, uso o aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el polietilenglicol de alto peso molecular es un polietilenglicol de 4 kDa.

14. Un aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13 para uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente.

15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de al menos un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, o una sal del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15 comprendiendo además la composición farmacéutica una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente citotóxico.

17. Una composición farmacéutica que comprende un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13 para uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente.

18. La composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 17 comprendiendo la composición farmacéutica una cantidad eficaz de al menos un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, o una sal del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 18 comprendiendo además la composición farmacéutica una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente

citotóxico.

2. Uso de un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en la preparación de una composición farmacéutica para administración simultánea o secuencial con un agente citotóxico para el tratamiento de cáncer en un paciente.

21. Uso de un agente citotóxico en la preparación de una composición farmacéutica para administración simultánea o secuencial con un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para el tratamiento de cáncer en un paciente.

22. Uso de un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en la preparación de una composición farmacéutica que comprende un agente citotóxico para el tratamiento de cáncer en un paciente.

23. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 22 en el que la composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de al menos un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, o una sal del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23 en el que la composición farmacéutica comprende además una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente citotóxico.

25. Un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13 para uso en un método de tratamiento de cáncer en un paciente, comprendiendo el método de tratamiento la administración simultánea o secuencial con un agente citotóxico.

26. Un agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer en un paciente, comprendiendo el método de tratamiento la administración simultánea o secuencial con un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13.

27. Agentes terapéuticos que contienen un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13 y un agente citotóxico como un a preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de cáncer.

28. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24, aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 25, agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 26 o agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 27 en el que el tratamiento de cáncer implica inhibir el crecimiento de un tumor.

29. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24, aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 25, agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 26 o agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 27 en el que el tratamiento de cáncer implica reducir la presión de líquido intersticial en un tumor sólido.

3. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24, aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 25, agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 26 o agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 27 en el que el tratamiento de cáncer implica aumentar la permeabilidad de un tumor sólido a un agente citotóxico.

31. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24, aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 25, agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 26 o agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 27 en el que el tratamiento de cáncer implica reducir la expresión constitutiva del factor de crecimiento derivado de plaquetas en un tumor.

32. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24, aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 25, agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer de la reivindicación 26 o agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 27 en el que el tratamiento de cáncer implica reducir la angiogénesis y la neovascularización en un tumor sólido.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24 o 28 a 32, aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 o 28 a 32, agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 o 28 a 32 o agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32 en el que el agente citotóxico es un estabilizador de tubulina, un desestabilizador de tubulina, un antimetabolito, un inhibidor de síntesis de purina, un análogo de nucleósido, un agente alquilante de ADN, un agente modificador de ADN o un agente alterador vascular.

34. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 24 o 28 a 32, aptámero para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las

reivindicaciones 25 o 28 a 32, agente citotóxico para uso en un método de tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 o 28 a 32 o agentes terapéuticos para uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32 en el que el agente citotóxico es caliqueamicina, doxorrubicina, taxol, metotrexato, gemcitabina, citarabina, vinblastina, daunorrubicina, docetaxel, irinotecán, 5 epotilona B, epotilona D, cisplatino, carboplatino o 5-fluoro-U.

35. Uso de un aptámero como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad en un paciente.