Aptámeros de unión a complemento y agentes anti-C5 útiles en el tratamiento de trastornos oculares.

Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la degeneración macular asociada a la edad (AMD) de tipo exudativo,

comprendiendo dicho método la etapa de administrar un aptámero pegilado a un sujeto que lo necesite, en donde el aptámero pegilado se une al complemento C5 y tiene la siguiente estructura:**Fórmula**

o una sal del mismo,

en donde el aptámero ≥**Fórmula**

en el que fC y fU ≥ 2'-fluoro nucleótidos, mG y mA ≥ 2'-OMe nucleótidos, los nucleótidos restantes son 2'-OH y 3T indica una desoxitimidina invertida.

Aptámeros de unión a complemento y agentes anti-C5 útiles en el tratamiento de trastornos oculares Campo de la invención La invención se refiere en general al campo de los ácidos nucleicos, y más particularmente a aptámeros capaces de unirse a las proteínas del sistema de complemento, útiles como agentes terapéuticos y diagnósticos en trastornos oftalmológicos relacionados con el complemento o trastornos en los que, especialmente, se ha implicado la activación del complemento mediada por C5. En realizaciones preferidas, la invención se refiere más específicamente a métodos y materiales para el tratamiento y detección de AMD de tipo exudativo. La divulgación se refiere además a materiales y métodos para la administración de aptámeros capaces de unirse a proteínas del sistema de complemento incluyendo proteínas C5.

Antecedentes de la invención Un aptámero, por definición, es una molécula de ácido nucleico aislado que se une con elevada especificidad y afinidad a alguna diana, tal como una proteína, mediante interacciones distintas al emparejamiento de bases de Watson-Crick. Aunque los aptámeros son moléculas basadas en ácidos nucleicos, hay una diferencia fundamental entre los aptámeros y otras moléculas de ácidos nucleicos, tales como genes y ARNm. En los últimos, la estructura de ácido nucleico codifica información a través de su secuencia lineal de bases y por lo tanto, esta secuencia es de importancia para la función de almacenamiento de la información. Por el contrario, la función del aptámero, que se basa en la unión específica de una molécula diana, no depende de una secuencia lineal de bases conservada, sino en una estructura secundaria/terciaria particular. Esto es, los aptámeros son secuencias no codificantes. Cualquier potencial de codificación que pueda poseer un aptámero es completamente fortuito y no juega absolutamente ningún papel en la unión de un aptámero a su diana afín. Por tanto, aunque puede haber aptámeros que se unan a la misma diana, e incluso al mismo sitio de la diana, compartiendo una secuencia lineal de bases similares, la mayoría no.

Los aptámeros también tienen que diferenciarse de las secuencias de ácidos nucleicos de origen natural que se unen a determinadas proteínas. Estas últimas secuencias son secuencias de origen natural embebidas dentro del genoma de los organismos que se unen a subgrupos de proteínas especializadas que están involucradas en la transcripción, traducción y transporte de ácidos nucleicos de origen natural, es decir, proteínas de unión a ácidos nucleicos. Por otro lado, los aptámeros son moléculas de ácido nucleico cortas, aisladas de origen no natural. Aunque pueden identificarse aptámeros que se unen a proteínas de unión a ácidos nucleicos, en la mayoría de los casos dichos aptámeros tienen poca o ninguna identidad de secuencia con las secuencias reconocidas por las proteínas de unión a ácido nucleico en la naturaleza. De manera más importante, los aptámeros pueden unirse virtualmente a cualquier proteína (no solo a proteínas de unión a ácido nucleico) así como a cualquier diana de interés, incluyendo moléculas pequeñas, hidratos de carbono, péptidos, etc. Para la mayoría de las dianas, incluso proteínas, no existe una secuencia de origen natural a la que se une; para aquellas secuencias que tienen dicha secuencia, es decir, proteínas de unión a ácidos nucleicos, dichas secuencias diferirán de los aptámeros como resultado de la relativamente baja afinidad de unión usada en la naturaleza en comparación con aptámeros de unión estrecha.

Los aptámeros, como los péptidos generados mediante presentación de fagos o anticuerpos, son capaces de unirse específicamente a dianas seleccionadas y modular la actividad de la diana o las interacciones de unión, por ejemplo, mediante la unión de aptámeros puede bloquearse la capacidad de funcionar de su diana. Como con los anticuerpos, esta propiedad funcional o unión específica a una diana, es una propiedad intrínseca. También como con los anticuerpos, aunque el experto en la materia puede conocer las características estructurales precisas que tendrá un aptámero, el experto en la materia sabe cómo identificar, preparar y usar dicha molécula en ausencia de una definición estructural precisa.

Los aptámeros también son análogos a agentes terapéuticos de molécula pequeña en que un solo cambio estructural, aunque parezca menor, puede afectar drásticamente (en varios órdenes de magnitud) a la unión y/o a otra actividad (o actividades) del aptámero. Por otra parte, algunos cambios estructurales tendrán poco o ningún efecto en absoluto. Esto es el resultado de la importancia de la estructura secundaria/terciaria de los aptámeros. En otras palabras, un aptámero es una estructura tridimensional sujeta en una conformación fija que proporciona contactos químicos para unirse específicamente a su diana específica. En consecuencia, (1) algunas áreas o secuencias particulares son esenciales como (a) puntos específicos de contacto con la diana, y/o como (b) secuencias que posicionen las moléculas en contacto con la diana; (2) algunas áreas o secuencias particulares tienen un intervalo de variabilidad, por ejemplo, el nucleótido X tiene que ser una pirimidina, o el nucleótido Y tiene que ser una purina, o los nucleótidos X e Y tiene que ser complementarios; y (3) algunas áreas o secuencias particulares pueden ser cualquier cosa, es decir, son esencialmente elementos espaciadores, por ejemplo, pueden ser cualquier cadena de nucleótidos de una longitud dada o incluso un espaciador no nucleotídico, tal como una molécula de PEG.

Descubiertos por un proceso de selección in vitro de grupos de oligonucleótidos de secuencia al azar, se han generado aptámeros para más de 130 proteínas, incluyendo factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas, y receptores. Un aptámero típico tiene un tamaño de 10-15 kDa (20-45 nucleótidos) , se une a su

diana con afinidad nanomolar o sub-nanomolar, y discrimina entre dianas estrechamente relacionadas (por ejemplo, los aptámeros no se unirán generalmente a otras proteínas de la misma familia de genes) . Una serie de estudios estructurales han demostrado que los aptámeros son capaces de usar los mismos tipos de interacciones de unión (por ejemplo, puentes de hidrógeno, complementariedades electrostáticas, contactos hidrófobos, exclusión estérica) que dirigen la afinidad y especificidad en complejos anticuerpo-antígeno.

Los aptámeros tienen un número de características deseables para su uso como agentes terapéuticos y diagnósticos incluyendo elevada especificidad y afinidad, eficacia biológica, y excelentes propiedades farmacocinéticas. Además, ofrecen ventajas competitivas específicas por encima de anticuerpos y otras proteínas biológicas, por ejemplo:

1) Velocidad y control. Los aptámeros se producen enteramente en un proceso in vitro, permitiendo la generación rápida de líderes iniciales, incluyendo líderes terapéuticos. La selección in vitro permite controlar de manera estrecha la especificidad y afinidad del aptámero y permite la generación de líderes, incluyendo líderes contra dianas tanto tóxicas como no inmunogénicas.

2) Toxicidad e inmunogenicidad. Los aptámeros como clase han demostrado una toxicidad terapéuticamente aceptable y carecen de inmunogenicidad. Mientras que la eficacia de muchos anticuerpos monoclonales puede limitarse fuertemente por la respuesta inmune a los propios anticuerpos, es extremadamente difícil suscitar anticuerpos contra aptámeros, lo más probablemente debido a que los aptámeros no pueden presentarse a linfocitos T mediante el CMH y a que la respuesta inmune está generalmente entrenada para no reconocer fragmentos de ácidos nucleicos.

3) Administración. Mientras que la mayoría de los agentes terapéuticos de anticuerpos se administran mediante infusión intravenosa (normalmente durante 2-4 horas) , los aptámeros pueden administrarse mediante inyección subcutánea (la biodisponibilidad de los aptámeros mediante administración subcutánea es > 80 % en los estudios en monos (Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999) ) . Esta diferencia se debe principalmente a la solubilidad comparativamente baja y por tanto a los grandes volúmenes necesarios para la mayor parte de los Acm terapéuticos. Con buena solubilidad (>150 mg/ml) y un peso molecular comparativamente bajo (aptámero: 10-50 kDa; anticuerpo: 150 kDa) , una dosis semanal de aptámero puede administrarse mediante inyección en un volumen de menos de 0, 5 ml. Además, el pequeño tamaño de los aptámeros les permite penetrar en zonas de constricciones conformacionales que no permiten penetrar a los anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la degeneración macular asociada a la edad (AMD) de tipo exudativo, comprendiendo dicho método la etapa de administrar un aptámero pegilado a un sujeto que lo necesite, en donde el aptámero pegilado se une al complemento C5 y tiene la siguiente estructura:

o una sal del mismo, en donde el aptámero =

en el que fC y fU .

2. fluoro nucleótidos, mG y mA = 2’-OMe nucleótidos, los nucleótidos restantes so.

2. OH y 3T indica una desoxitimidina invertida.

2. Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la degeneración macular asociada a la edad (AMD) de tipo exudativo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende adicionalmente la etapa de administrar al sujeto un agente anti-VEGF, en donde el agente anti-VEGF es un anticuerpo antagonista o fragmento de anticuerpo dirigido contra VEGF.

3. Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la AMD de tipo exudativo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aptámero pegilado o el agente anti-VEGF se administran mediante administración ocular, administración intravítrea o administración periocular.

4. Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la AMD de tipo exudativo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aptámero pegilado o el agente anti-VEGF están presentes en una formulación de depósito.

5. Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la AMD de tipo exudativo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el aptámero pegilado y el agente anti-VEGF se administran secuencialmente o de manera sustancialmente simultánea.

6. Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la AMD de tipo exudativo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el agente anti-VEGF es ranibizumab.

7. Un aptámero pegilado para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la AMD de tipo exudativo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el agente anti-VEGF es bevacizumab.

8. Uso de un aptámero pegilado en la fabricación de una composición farmacéutica para su uso en un método para tratar, estabilizar y/o prevenir la AMD de tipo exudativo, comprendiendo el método la etapa de administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, en donde el aptámero pegilado se une al complemento C5 y tiene la siguiente estructura:

o una sal del mismo, en donde el aptámero = en el que fC y fU .

2. fluoro nucleótidos, mG y mA = 2’-OMe nucleótidos, los nucleótidos restantes so.

2. OH, y 3T indica una desoxitimidina invertida.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que el método comprende adicionalmente la etapa de administrar al sujeto un agente anti-VEGF, en donde el agente anti-VEGF es un anticuerpo antagonista o un fragmento de anticuerpo dirigido contra VEGF.

10. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en el que la composición farmacéutica o el agente anti-VEGF se administran mediante administración ocular, administración intravítrea o administración periocular. 10

11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la composición farmacéutica es una formulación en depósito o el agente anti-VEGF está presente en una formulación en depósito.

12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la composición farmacéutica y el 15 agente anti-VEGF se administran secuencialmente o de manera sustancialmente simultánea.

13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el agente anti-VEGF es ranibizumab.

14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el agente anti-VEGF es bevacizumab.

Dimerización mediante PEGilación

Figura 7B

Nº DE ARC Modificación de PEG CI50 (nM)

186 Sin PEG 0, 5 ±0, 1

657 ARC186 + 20 kDa 0, 6 ±0, 1

658 ARC186 + 30 kDa 0, 5 ±0, 1

187 1, 3 bis (mPEG-[20 kDa]) propil-2- (4'-butamida) ramificado de 40 kDa 0, 6 ±0, 2

Figura 7D

Nº de ARC Modificación de PEG CI50 (nM)

187 1, 3 bis (mPEG-[20 kDa]) propil-2- (4'-butamida) ramificado de 40 K 0, 38 ± 0, 03

1537 Dow lineal de 40 K 0, 39 0, 06

1730 2 x 20K lineal 0, 48 0, 04

1905 2, 3 bis (mPEG-[20 kDa]) propil-1-carbamoílo ramificado de 40 K 0, 40 0, 03

Figura 23

Grupo Nº de ratones Artículo de ensayo Dosis Medidas

Conc. (nM) Velocidad de perfusión ml/min

1 5 Sin aptámero 0 3 Frecuencia cardiaca, ritmo, presión del ventrículo izquierdo

3 3 Aptámero irrelevante a relación molar 50 X 1500 3 Frecuencia cardiaca, ritmo, presión del ventrículo izquierdo

4 3 ARC 186 a equivalencia molar 30 3 Frecuencia cardiaca, ritmo, presión del ventrículo izquierdo

5 5 ARC 186 relación molar 10 X 300 3 Frecuencia cardiaca, ritmo, presión del ventrículo izquierdo

6 4 ARC 186 a relación molar 50 X 1500 3 Frecuencia cardiaca, ritmo, presión del ventrículo izquierdo

Figura 31

Animal Tratamiento Irrelevante C3b C5b-9

1-001 (1/26) Ninguno neg Pos pos

1-002 (1-26) Ninguno neg Pos pos

1-001 Ninguno neg Pos pos

1-002 Ninguno neg Pos pos

1-003 Ninguno neg Pos pos

3-001 Aptámero irrelevante 50 X molar neg Pos pos

3-002 Aptámero irrelevante 50 X molar neg Pos pos

3-003 Aptámero irrelevante 50 X molar neg Pos pos

4-001 Aptámero de C5 equivalencia molar neg Pos pos

4-002 Aptámero de C5 equivalencia molar neg Pos pos

4-003 Aptámero de C5 equivalencia molar neg Pos pos

5-001 Aptámero de C5 equivalencia molar 10 X neg Pos neg

5-002 Aptámero de C5 equivalencia molar 10 X neg Pos neg

5-003 Aptámero de C5 equivalencia molar 10 X neg Pos neg

5-004 Aptámero de C5 equivalencia molar 10 X neg Pos neg

5-005 Aptámero de C5 equivalencia molar 10 X neg Pos neg

6-001 Aptámero de C5 equivalencia molar 50 X neg Pos neg

6-002 Aptámero de C5 equivalencia molar 50 X neg Pos neg

6-003 Aptámero de C5 equivalencia molar 50 X neg Pos neg

6-004 Aptámero de C5 equivalencia molar 50 X neg Pos neg

Figura 32

Animal Compuesto Suero Relación molar EDP aumentado Fallo [S o N] Tiempo hasta el fallo

1-001 ARC658 Humano 0 S S 4 min 30 s

1-002 AP.C658 Humano 0 S S 4 min 38 s

1-003 ARC658 Humano 0 S S 3 min 20 s

1-004 ARC658 Humano 0 S S 12 min 24 s

1-005 ARC658 Humano 0 S N NA

1-006 ARC659 Humano 0 S S 8 min 30 s

1a-001 ARC659 Humano 0, 6 S S 7 min 22 s

1a-002 ARC658 Humano 0, 5 S S 7 min 30 s

1a-003 ARC658 Humano 0, 5 S S 8 min 3 s

2-001 ARC658 Humano 1 N N NA

2-002 ARC658 Humano 1 N N NA

2-003 ARCES8 Humano 1 N N NA

2-004 ARC658 Humano 1 N N NA

3-001 ARC658 Humano 3 N N NA

3-002 ARC658 Humano 3 N N NA

3-003 ARC658 Humano 3 N N NA

6-001 ARC658 Primate 0 S S 2 min 30 s

6-002 ARC658 Primate 0 S S 2 min 47 s

6-003 ARC658 Primate 0 S S 3 min 30 s

6-004 ARC658 Primate 0 S S 1 min 28 s

6a-001 ARC658 Primate 3 S S 5 min 2 s

6a-002 ARCS58 Primate 3 S S 4 min 30 s

6a-003 ARC658 Primate 3 S S 3 min 43 s

6a-004 ARC658 Primate 3 S S 8 min 0 s

7-001 ABC658 Primate 10 S N NA

7-002 ARC658 Primate 10 S N NA

7-003 ARC658 Primate 10 S S 9 min 15 s

7-004 ARC658 Primate 10 S N NA

9-001 ARC658 Primate 20 S S 12 min 50 s

11-001 ARC658 Primate 30 S N NA

11-002 ARC658 Primate 30 S S 10 min 0 s

11-003 ARC658 Primate 30 S N NA

13-001 ARC658 Primate 50 N N NA

13-002 ARC658 Primate 50 N N NA

13-003 ARC658 Primate 50 N N NA

Figura 34

Número de grupo Número de animales Artículo de ensayo Nivel de dosificación (mg/kg) Volumen de dosis (ml/kg) Régimen de dosificación Recogida de muestras

1 3 ARC657 PEG de 20 kDa 10 1 Bolo intravenoso el día 1 t = antes de la dosis, 0, 5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32, 48 horas

2 3 ARC658 PEG de 30 kDa 10 1 Bolo intravenoso el día 1 t = antes de la dosis, 0, 5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32, 48 horas

3 3 ARC 187 PEG de 40 kDa 10 1 Bolo intravenoso el día 1 t = antes de la dosis, 0, 5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32, 48 horas

Figura 35

PK de Conjugados de Aptámero Anti-C5-PEG en Ratas Sprague Dawley

Aptámero ARC657 ARC658 ARC187

Grupo de PEG 20 kDa 30 kDa 40 kDa

MEDIA DESV. TIP MEDIA DESV. TIP MEDIA DESV. TIP

Tiempo (horas) Cp (μM) Cp (μM) Cp (μM) Cp (μM) Cp (μM) Cp (μM)

0 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00

0, 5 12, 77 2, 67 2, 97 0, 62 6, 52 1, 77

1 13, 38 2, 08 4, 09 1, 44 7, 94 1, 08

2 6, 63 1, 87 3, 40 0, 66 6, 57 1, 56

4 2, 38 0, 87 2, 22 0, 39 4, 56 0, 54

8 0, 72 0, 18 2, 87 1, 84 1, 53 0, 57

12 0, 31 0, 03 0, 60 0, 09 1, 45 0, 17

24 <LIDC <LIDC 0, 47 0, 17 0, 73 0, 03

32 <LIDC <LIDC <LIDC <LIDC 0, 49 0, 01

48 <LIDC <LIDC <LIDC <LIDC 0, 27 0, 02

Figura 37

Especie Dosis (mg/kg) Vía de admin. Grupo de PEG Cmáx ( g/ml) ABC0. ( g h/ml) t1/2 ( ) / (h) t1/2 ( ) / (h) Cl (ml/min kg) Vss (ml/kg)

rata 10 IV 20 kD 169, 97 458 - 2, 05 0, 36 65

rata 10 IV 30 kD 52, 00 497 - 7, 40 0, 34 220

rata 10 IV 40 kD 100, 85 886 - 15, 00 0, 19 188

Figura 38A

Nº de grupo Nº de animales Artículo de ensayo Dosis Vía de la dosis Recogida de muestras

(mg/kg) (ml/kg)

1 33F ARC 187 10 4 IV t = antes de la dosis, 0, 5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32, 48, 72 horas

2 33F ARC1905 10 4 IV t = antes de la dosis, 0, 5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32, 48, 72 horas

Figura 38C

Análisis de FC no compartimental (NCA)

Atributo Unidad ARC1905 ARC 187

Cmáx M 12 10

ABC0. M-h 88 89

MRT0. h 11 11

CL ml/min-kg 0, 15 0, 15

Vss ml/kg 95 96

K10 1/h 0, 151 0, 121

t1/2 (K10) h 5 6

Figura 39

Aptámero Antes 1 h 3 h 6 h

ARC657 No Sí Sí Sí

ARC658 No Sí Sí Sí

ARC187 No Sí Sí Sí

Figura 40

Número Número de Artículo Nivel de Volumen Régimen Recogida de muestras

de grupo animales de ensayo dosificación de dosis de

(mg/kg) (ml/kg) dosificación

1 1 ARC657 PEG de 20 kDa 30 3 Bolo intravenoso en el día 1 t = antes de la dosis, 1, 5, 10, 15 y 30 minutos y a las 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 y 192 horas

2 1 ARC658 PEG de 30 kDa 30 3 Bolo intravenoso en el día 1 t = antes de la dosis, 1, 5, 10, 15 y 30 minutos y a las 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 y 192 horas

3 1 ARC187 PEG de 40 kDa 30 3 Bolo intravenoso en el día 1 t = antes de la dosis, 1, 5, 10, 15 y 30 minutos y a las 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 y 192 horas

Figura 41

PC de conjugados de aptámero anti-C5-PEG en macacos cinomolgos

Aptámero ARC657 ARC658 ARC187

Grupo de PEG 20 kDa 30 kDa 40 kDa

MEDIA MEDIA MEDIA

Tiempo (horas) Cp ( M) Cp ( M) Cp ( M)

0 0, 00 0, 00 0, 00

0, 08 16, 41 21, 99 18, 00

0, 25 16, 64 22, 67 17, 26

0, 5 19, 38 26, 16 24, 17

1 19, 36 27, 08 21, 79

4 7, 73 14, 16 21, 69

8 2, 03 6, 02 16, 68

12 1, 10 3, 04 13, 11

24 0, 36 0, 95 7, 24

48 0, 15 0, 42 2, 30

72 0, 07 0, 25 0, 96

96 0, 03 0, 23 0, 54

192 0, 01 0, 04 0, 14

Figura 42

Especie Dosis (mg/kg) Vía de admin. Grupo de PEG Cmáx ( g/ml) ABC0. ( g h/ml) t1/2 ( ) / (h) t1/2 ( ) / (h) Cl (ml/min kg) Vss (ml/kg)

primate 30 iv 20 kD 293 1191 2, 35 31, 80 0, 41 273

primate 30 iv 30 kD 385 2484 3, 33 40, 08 0, 20 233

primate 30 iv 40 kD 316 6752 12, 38 60, 11 0, 07 141

Figura 44

Número de grupo Número de animales Artículo de ensayo Nivel de dosificación (mg/kg) Volumen dosis (ml/kg) de Régimen dosificación de Recogida de muestras

1 4 ARC658 PEG de 30 kDa 30 3 Bolo intravenoso el día 1 t = antes de la dosis, 1, 5, 10, 15 y 30 minutos y a las 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 y 192 horas

2 4 ARC187 PEG 40 kDa 30 3 Bolo intravenoso el día 1 t = antes de la dosis, 1, 5, 10, 15 y 30 minutos y a las 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 y 192 horas

Figure 46

Especie Dosis (mg/kg) Vía de admin. Grupo de PEG Cmáx ( g/ml) ABC0. ( g h/ml) t1/2 ( ) / (h) t1/2 ( ) / (h) Cl (ml/min kg) Vss (ml/kg)

primate 30 IV 30 kD 519 3059 2, 35 30, 45 0, 16 213

primate 30 IV 40 kD 609 8061 4, 48 53, 13 0, 06 168

Figura 49

Número Número Artículo Nivel de Concentración Volumen Régimen Ultimo

de de de ensayo dosificación de dosis de dosis de dosificación día

grupo animales (mg/kg) (mg/kg) (ml/kg) de ensayo

1 3 ARCI87 1 mg/kg bolo IV y 0, 0013 mg/kg/min infusión IV 10 0, 1 ml/kg, bolo IV y 0, 1872 ml/kg/día, Infusión IV Bolo IV y 48 horas de infusión el día 1 Día 8

Figura 50

Especie Dosis (mg/kg) Vía de admin. Grupo de PEG Cmáx ( g/ml) ABC0. ( g h/ml) t1/2 ( ) / (h) t1/2 ( ) / (h) Cl (ml/min kg) Vss (ml/kg)

primate 30 IV 40 kD 610 8061 4, 48 53, 13 0, 06 168

Figura 53

Aptámero Grupo de PEG Peso molecular (oligo) Peso molecular (total) t1/2 ( ) (h) t1/2 ( ) (h) Dosis total (oligo) para 1, 5 M (g)

ARC187 40 kDa 12, 703 52, 703 4, 48 53, 13 0, 40

Figura 55

Tratamiento ACT (segundos)

Donante 1a Donante 2b Donante 3b

inicial 133 30 145 12 138 1

+ heparina 842 95 519 16 450 15

+ heparina y ARC 187 nd 618 55 492 28

+ heparina y protamina 160 11 155 6 159 9

+ heparina, protamina y ARC 187 200 5 172 1 169 8

a

U/ml de heparina; b 4 U/ml heparina; nd, no determinado

Figura 59B

Especie de suero ARC1905 CI50 (nM) ARC127 CI50 (nM)

Humano 0, 349 0, 0898 > 10.000 NA

Mono Cynomolgus 3, 69 0, 603 > 10.000 NA

Rata 2700 470 ~ 10.000 NA

Figura 63

Aptámero CI50 (nM) CI90 (nM) CI99 (nM)

Humano 196 13, 9 442 23, 2 1090 198, 0

Macaco Cynomolgus 536 54, 7 1810 405, 8 6900 2600

Relación cino/humano 2, 73 0, 339 4, 1 0, 94 6, 4 2, 65

Figura 66

Donante CI50 (nM) CI90 (nM) CI99 (nM)

Media de 5 119 268 694

donantes

28, 6 39, 2 240, 9

DT