Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de tirotropina que actúan como antagonistas.

Un anticuerpo monoclonal humano aislado para el Receptor de Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) que es un antagonista de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSH) y tiene una afinidad de unión por el TSHR humano de longitud completa de aproximadamente 109 l/mol,

en donde el anticuerpo comprende una región 5 VH que comprende: SNYMS (CDR1);

VTYSGGSTSYADSVKG (CDR2); y

GGRYCSSISCYARSGCDY (CDR3),

y una región VL que comprende:

RASQSISNYLN (CDR1);

AASSLQS (CDR2); y

QQSYSSPSTT (CDR3).

Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de tirotropina que actúan como antagonistas

Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos que son reactivos con el receptor de tirotropina (TSH) (TSHR) y, en particular, aunque no exclusivamente, a anticuerpos que se unen con el TSHR y que pueden bloquear la estimulación del TSHR por anticuerpos estimulantes de TSH o TSHR.

Antecedentes La tirotropina, u hormona estimulante del tiroides (TSH) , es una hormona de la hipófisis que regula la función tiroidea mediante el TSHR (Szkudlinski MW, Fremont V, Ronin C, Weintraub BD 2002 Thyroid-stimulating hormone and TSHR structure function relationships. Physiological Reviews 82: 473-502) . El TSHR es un receptor acoplado a proteína G y está compuesto de tres dominios: un dominio rico en leucina (LRD) , un dominio de escisión (CD) y un dominio transmembrana (TMD) (Nunez Miguel R, Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Blundell TL, Rees Smith B, Furmaniak J 2004 Analysis of the thyrotropin receptor-thyrotropin interaction by comparative modelling. Thyroid 14: 991-1011) . La unión de TSH con el TSHR desencadena la señalización del receptor que conduce a la estimulación de la formación y liberación de hormonas tiroideas; tiroxina (T4) y triyodotironina (T3) . Un mecanismo de retroalimentación negativa que implica los niveles T4 y T3 en la circulación controla la liberación de TSH de la hipófisis (y hormona liberadora de tirotropina secretada por el hipotálamo) que a su vez controla la estimulación del tiroides y los niveles de hormonas tiroideas en el suero.

Está bien documentado en la técnica que algunos pacientes con enfermedad de tiroides autoinmunitaria (AITD) tienen autoanticuerpos reactivos con TSHR (Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121) . En la mayoría de los casos, estos anticuerpos se unen con el TSHR e imitan las acciones de la TSH estimulando de este modo al tiroides para que produzca altos niveles de T4 y T3. Estos autoanticuerpos se describen como autoanticuerpos estimulantes del tiroides o autoanticuerpos de TSHR (TRAb) con actividad estimulante o actividad agonista de TSH. El mecanismo de retroalimentación fisiológica de control de la función tiroidea mencionado anteriormente no es eficaz en presencia de dichos anticuerpos estimulantes del tiroides y pacientes presentes con síntomas de hiperactividad tiroidea o tirotoxicosis (exceso de hormonas tiroideas en el suero) . Esta afección se conoce como enfermedad de Graves. En algunos pacientes se cree que los TRAb con actividad estimulante son responsables de la interacción con TSHR en tejidos retro-orbitales y que contribuyen a las señales oculares de la enfermedad de Graves. Se ha descrito con detalle un autoanticuerpo monoclonal humano que actúa como un potente estimulante del tiroides (hMAb TSHR1) en la Solicitud de Patente WO2004/050708A2.

A diferencia de algunos pacientes con AITD, los autoanticuerpos se unen con el TSHR, impiden que la TSH se una con el receptor pero no tienen la capacidad de estimular al TSHR. Estos tipos de autoanticuerpos se conocen como TRAb con actividad de bloqueo o actividad antagonista de TSH, y los pacientes que tienen TRAb de bloqueo en su suero pueden presentar síntomas de un tiroides hipofuncionante (hipotiroidismo) (Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121) . En particular, los TRAb con actividad de bloqueo cuando están presentes en el suero de mujeres embarazadas cruzan la placenta y pueden bloquear los TSHR de tiroides fetal conduciendo a hipotiroidismo neonatal y consecuencias graves para el desarrollo. Además, pueden encontrarse TRAb con actividad de bloqueo en la leche materna de madres afectadas y esto puede contribuir además al hipotiroidismo clínico en el bebé. Hasta la fecha no han estado disponibles autoanticuerpos monoclonales humanos para el TSHR con actividad antagonista de TSH. En consecuencia, los estudios detallados de cómo este tipo de autoanticuerpos interacciona con el TSHR, y cómo sus interacciones con el TSHR se comparan con las de tipo estimulante de autoanticuerpos (tales como M22) y con TSH, han estado limitados.

La gonadotropina coriónica humana es una hormona producida durante el embarazo que tiene efectos estimulantes del tiroides leves.

La caracterización de las propiedades de TRAb con actividades de estimulación o bloqueo es de importancia crítica en estudios que se dirigen a mejorar el diagnóstico y control de enfermedades asociadas con una respuesta autoinmunitaria al TSHR. La invención descrita en la Solicitud de Patente WO2004/050708A2 proporciona detalles acerca de las propiedades de un autoanticuerpo monoclonal humano con actividad estimulante potente y su interacción con el TSHR. Además la Solicitud de Patente WO2006/016121A desvela una preparación de TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual que puede usarse en la exploración e identificación diferencial de autoanticuerpos de TSHR estimulantes en suero de pacientes, autoanticuerpos de TSHR de bloqueo en suero de pacientes y TSH en una muestra de fluido corporal de un paciente que se explora. La Solicitud de Patente WO2004/050708A2 también describe un anticuerpo monoclonal de ratón (9D33) con actividad de bloqueo de TSHR. 9D33 se une con el TSHR con alta afinidad (2x1010 l/mol) y es un antagonista eficaz de TSH, hMAb TSHR1 (M22) y TRAb en suero de pacientes con actividades de estimulación o de bloqueo (Solicitud de Patente WO2004/050708A2

y J, Allen F, Jeffreys J, Bolton J, Richards T, Depraetere H, Nakatake N, Evans M, Kiddie A, Premawardhana LD, Chirgadze DY, Miguel RN, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2005 Characteristics of a monoclonal antibody to the thyrotropin receptor that acts as a powerful thyroid-stimulating autoantibody antagonist. Thyroid 15: 672-682) . Aunque el anticuerpo monoclonal de ratón 9D33 muestra al menos algunas de las características de los TRAb de suero de pacientes con actividad de bloqueo, es un anticuerpo de ratón generado por inmunización de un animal experimental con el TSHR y como tal puede no ser verdaderamente representativo de autoanticuerpos de TSHR generados en el proceso de una respuesta autoinmunitaria al TSHR en seres humanos. Como un anticuerpo monoclonal de ratón sería necesario humanizar 9D33 para aplicaciones in vivo en seres humanos. Esto puede ser desventajoso a la vista del gasto y la complicación implicados en el proceso de humanización.

Los efectos de una serie de mutaciones en el dominio rico en leucina de TSHR sobre la capacidad de los anticuerpos monoclonales estimulantes del tiroides y la TSH para unirse con el receptor y estimular la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR se conocen de Jane Sanders Jane Bolton, Paul Sanders, Jennifer Jeffreys, Nobuhiro Nakatake, Tonya Richards, Michele Evans, Angela Kiddle, Sara Summerhayes, Emma Roberts, Ricardo Nunez Miguel, Jadwiga Furmaniak y Bernard Rees Smith 2006 Effects of TSH Receptor Mutations on Binding and Biological Activity of Monoclonal Antibodies and TSH. Thyroid 16: 1195-1206.

La presente invención resulta de la producción y propiedades de un autoanticuerpo monoclonal humano (5C9) para el TSHR que es un antagonista eficaz de TSH y de TRAb estimulantes en sueros de pacientes. Se ha aislado 5C9 de los linfocitos periféricos de un paciente con hipotiroidismo y altos niveles de autoanticuerpos de TSHR. Los linfocitos se inmortalizaron por infección con virus de Epstein Barr (EBV) y clones positivos fusionados con una línea celular de ratón/humana para generar un clon estable. Se purificó IgG de sobrenadantes de cultivos de clones y se evaluó la capacidad del IgG 5C9 para unirse con el TSHR e influir en la actividad del TSHR. En particular, se estudió la capacidad de 5C9 para inhibir la unión de TSH con el TSHR, y para inhibir la actividad estimulante de AMP cíclico de TSH. Además, también se evaluó la capacidad de 5C9 para inhibir la unión de TRAb del suero de pacientes estimulantes o de bloqueo con el TSHR y para inhibir su actividad biológica. Además, se investigó el uso de 5C9 en ensayos para anticuerpos de TSHR, TSH y compuestos relacionados. Se secuenciaron genes de región variable (región V) de las cadenas pesada (HC) y ligera (LC) de 5C9 y se asignaron las regiones determinantes de complementariedad (CDR) .

Sumario de la invención De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado para el Receptor de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) que es un antagonista de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) y tiene una afinidad de unión por el TSHR humano de longitud completa de... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado para el Receptor de Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) que es un antagonista de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSH) y tiene una afinidad de unión por el TSHR humano de longitud completa de aproximadamente 109 l/mol, en donde el anticuerpo comprende una región VH que comprende:

SNYMS (CDR1) ; VTYSGGSTSYADSVKG (CDR2) ; y GGRYCSSISCYARSGCDY (CDR3) ,

y una región VL que comprende:

RASQSISNYLN (CDR1) ; AASSLQS (CDR2) ; y QQSYSSPSTT (CDR3) .

2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 9 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 7 y la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 10 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº : 8.

3. Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 que tiene una afinidad de unión por el TSHR de longitud completa humano de aproximadamente 1010 l/mol.

4. Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3 que inhibe la actividad constitutiva de TSHR.

5. Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4 que es un antagonista de anticuerpos estimulantes del tiroides.

6. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 que es un antagonista de la TSH y es un antagonista de anticuerpos estimulantes del tiroides.

7. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que es un inhibidor de la unión con TSHR o una parte del mismo por TSH, por anticuerpos con actividad estimulante o anticuerpos con actividad de bloqueo para el TSHR.

8. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la parte de TSHR incluye el Dominio Rico en Leucina (LRD) de TSHR o una parte sustancial del mismo.

9. Un nucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un vector que comprende un nucleótido de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una célula aislada que incluye un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. Una composición que comprende una concentración definida de autoanticuerpos de TSHR y que incluye un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, incluyendo la composición uno o más antagonistas del receptor de la hormona estimulante del tiroides adicionales.

15. Un método para producir un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el método cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 11 por lo que el anticuerpo es expresado por la célula.

16. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en terapia médica.

17. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en el tratamiento de una afección relacionada con el tiroides.

18. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17 en el que la afección relacionada con el tiroides se selecciona de hiperactividad del tiroides, enfermedad ocular de Graves, hipertiroidismo neonatal, hipertiroidismo inducido por

gonadotropina coriónica humana, mixoedema pretibial, cáncer de tiroides y tiroiditis.

19. Un método para caracterizar anticuerpos de TSHR, comprendiendo el método determinar la unión de un anticuerpo de TSHR que se ensaya con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR en donde el método implica una etapa de método que incluye el uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, comprendiendo el método determinar los efectos de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la unión de un anticuerpo de TSHR con ese polipéptido.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que el polipéptido relacionado con TSHR comprende TSHR humano de longitud completa.

22. Un método para caracterizar la TSH y moléculas relacionadas, que comprende determinar la unión de la TSH o de una molécula relacionada que se ensaya con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR, en donde el método implica una etapa de método que incluye el uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22 en un formato de ELISA.

24. Un método para determinar los aminoácidos de TSHR implicados en la unión de autoanticuerpos de TSHR que actúan como antagonistas, comprendiendo el método proporcionar un polipéptido que tiene una primera secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR a la que se une un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, modificar al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR y determinar el efecto de dicha modificación en la unión del anticuerpo.

25. Un método para modificar un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el método modificar al menos un aminoácido del anticuerpo y determinar un efecto de dicha modificación en la unión con una secuencia relacionada con TSHR.

26. Un método para identificar moléculas que inhiben anticuerpos estimulantes del tiroides que se unen con el TSHR, comprendiendo el método proporcionar al menos un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como referencia.

27. Un método para identificar moléculas que inhiben anticuerpos de bloqueo del tiroides que se unen con el TSHR, comprendiendo el método proporcionar al menos un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como referencia.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 27 en el que se seleccionan moléculas que impiden la unión de anticuerpos de bloqueo del tiroides con TSHR.