Anticuerpos frente a variante truncada CTF-611 de HER2.

Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2,

estando dicho epítopo definido por una secuencia incluida en SEQ ID NO: 2, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen - DSMZ" con el número de registro DSM ACC3016 o la línea celular de hibridoma depositada en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen - DSMZ" con el número de registro DSM ACC3017, y en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo puede discriminar entre la variante truncada CTF611 representada por SEQ ID NO: 1 y CTF-616 representada por SEQ ID NO: 7, de HER2

Anticuerpos frente a variante truncada CTF-611 de HER2

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico en muestras aisladas de cánceres que expresan la variante truncada CTF-611 del receptor HER2. La invención también proporciona compuestos para su uso en el diagnóstico y la identificación tempranos del cáncer así como para su uso en terapia.

Técnica anterior

HER2 (también conocido como c-erbB2, ErbB2 o Neu) es una proteína transmembrana de tipo I que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico o EGFR, también conocida como HER1 o ErbB1. Dos miembros adicionales, HER3 y HER4 completan esta familia. Cuando HER1, 3 ó 4 se une a un ligando de tipo EGF, su dominio extracelular adopta la conformación denominada “abierta”, que permite la formación de homodímeros y heterodímeros. Aunque no se una a ningún ligando, HER2 también interacciona con otros receptores HER unidos a un ligando, debido al hecho de que su dominio extracelular es de conformación constitutivamente “abierta”.

La dimerización dirigida por el dominio extracelular conduce a la interacción de la cinasa intracelular de los receptores HER y a la posterior transfosforilación de algunos residuos de tirosina. Estas fosfotirosinas actúan como acopladores de un grupo de proteínas de unión a fosfotirosina intracelular. Las interacciones establecidas en la membrana plasmática se transducen al núcleo celular por medio de diferentes rutas de señalización, tales como la ruta de la proteína cinasa activada por proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) , la ruta de la proteína cinasa activada por estrés (JNK) , fosfolipasa C gamma, etc. Todos estos circuitos de señalización controlan la expresión de genes que actúan de manera coordinada para modificar aspectos determinantes del estado de la célula, tales como proliferación, migración, supervivencia y adhesión celular. Por tanto, dependiendo del contexto celular, la activación de los receptores HER da como resultado una respuesta celular drástica, que puede oscilar entre la transformación en una célula maligna y una senescencia prematura.

En tumores de mama humanos, se ha encontrado a menudo una serie de fragmentos carboxilo terminales o CTF, que se supone que incluyen los dominios transmembrana y citoplasmático de HER2 (Molina et al, “NH (2) -terminal truncated HER2 protein but not full-length receptor is associated with nodal metastasis in human breast cancer”, Clinical Cancer Research-2002, Vol. 8, págs. 347-353) . También se sabe que pacientes con cáncer de mama que expresan los CTF de HER2, o lo que viene a ser lo mismo, formas truncadas que no incluyen el extremo N-terminal de HER2 (CTF de HER2) , tienen una mayor probabilidad de desarrollar metástasis (Molina et al. 2002, citado anteriormente) y un pronóstico peor que aquellas pacientes que expresan principalmente la forma completa de HER2 (Saez et al., “p95HER2 predicts worse outcome in patients with HER2-positive breast cancer”, Clinical Cancer Research-2006, Vol. 12, págs. 424-431) .

Por tanto, es muy importante poder detectar la presencia de HER2 en tumores a tiempo e incluso más importante determinar si está en una forma completa o truncada (CTF) .

Actualmente, a nivel de las pruebas clínicas de rutina se usan anticuerpos para detectar la presencia de la forma completa de HER2, con el fin de determinar el tipo de tumor de mama en cuestión. En el caso de detectar la presencia de HER2, la terapia recomendada consiste en administrar anticuerpos monoclonales terapéuticos, tales como trastuzumab de Genentech. El uso de este anticuerpo monoclonal para el tratamiento del cáncer se describe en la solicitud WO 8906692 a nombre de Genentech. El documento WO 8906692 describe anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la región extracelular de HER2, correspondiendo esta región extracelular con la parte externa completa de la proteína, que es su extremo N-terminal. Tal como se mencionó anteriormente, los epítopos reconocidos por los anticuerpos citados en el documento WO 8906692 son regiones antigénicas del dominio extracelular de la forma completa de HER2 y no se incluyen en las formas truncadas o fragmentos carboxilo terminales de HER2. Por tanto, con los anticuerpos y el método de diagnóstico descrito en el documento WO 8906692 no será posible detectar la presencia de HER2 truncado (CTF) . Además, en los tumores de mama en los que se expresan dichos CTF de HER2, los anticuerpos tales como trastuzumab no son terapéuticos, ya que no reconocen ningún epítopo. Este hecho explica la resistencia al tratamiento con trastuzumab observada en pacientes que expresan formas truncadas (CTF) de HER2.

Las pacientes que expresan formas truncadas o CTF de HER2 deben tratarse con terapias alternativas con el fin de evitar los números de mal pronóstico observados por Saez et al 2006 (citado anteriormente) . Con el fin de detectar (diagnosticar) y tratar lo antes posible personas que tienen tumores en los que se expresan formas truncadas de HER2, es muy interesante poder distinguir qué forma de HER2 se expresa con el fin de actuar en consecuencia.

El documento de Anido et al., “Biosynthesis of tumorigenic HER2 C-terminal fragments by alternative initiation of translation”, European Molecular Biology Organization (EMBO) Journal -2006, Vol. 25, págs. 3234-3244, describe que además del fragmento generado por la acción de las alfa-secretasas en el HER2, que da lugar a una forma truncada (CTF) conocida como P95 que incluye el fragmento transmembrana y citoplasmático del receptor, también se generan dos formas truncadas (CTF) a través de un mecanismo de inicio alternativo de la traducción que

comienza a partir de dos metioninas ubicadas en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’, respectivamente, del dominio transmembrana de HER2. Específicamente, las metioninas para el inicio alternativo de la traducción corresponden a la metionina 611 y la metionina 687 de la secuencia de aminoácidos con número de registro M11730.1 de la base de datos UniGene del National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Este documento también muestra que estas formas alternativas del receptor HER2 (CTF) están presentes en tumores de mama. En particular, indica que las más abundantes corresponden a la forma conocida como CTF687, o en otras palabras, a la proteína obtenida mediante el inicio alternativo de la traducción que comienza a partir de la metionina en la posición 687. Anido et al. proponen como terapia el uso de inhibidores de la actividad tirosina cinasa de HER2, tales como lapatinib, con el fin de minimizar el crecimiento de los tumores que expresan estas formas truncadas de HER2. Los inhibidores de las tirosina cinasas actúan mediante la interacción con el extremo C-terminal del receptor HER2 que está presente de manera integral tanto en el receptor completo como en los CTF derivados del mismo o producidos mediante el inicio alternativo de la traducción.

El documento de Scaltriti et al, “Expression of p95HER2, a truncated form of the HER2 Receptor, and response to anti-HER2 therapies in breast cancer”, Journal of National Cancer Institute-2007, Vol. 99, págs. 628-368, representa un ejemplo de un estudio dando lugar a una metodología alternativa para detectar la presencia de una de las formas truncadas del receptor HER2 y enumera algunas de las posibles causas de resistencia al tratamiento con trastuzumab (Herceptin) . En particular, hace hincapié en la acumulación del fragmento p95HER2 (producto de la proteólisis de HER2 mediante alfa-secretasas) y otras formas truncadas del receptor, que no tienen el dominio extracelular reconocido por Trastuzumab. Scaltriti propone un método de inmunofluorescencia para detectar el fragmento p95HER2 (producto de proteólisis mediante alfa-secretasas) . Este nuevo método de detección puede llevarse a cabo en cortes de tejido embebidos en parafina y fijados con formalina siguiendo protocolos clínicos. La nueva metodología surge de la observación de que la forma truncada p95HER2, y no la forma entera del receptor, se ubica tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma de la célula. Este método propone comparar si hay expresión de p95HER2 por medio de la tinción del citoplasma detectado con un anticuerpo anti-HER2 que se une al dominio citoplasmático del receptor; y confirmar estos resultados con los de una detección con un anticuerpo anticitoqueratina, una proteína cuya distribución se ha usado ampliamente como herramienta para el diagnóstico de tumores. Sin embargo, no está claro si este método distingue de manera eficaz aquellos tumores que expresan la forma completa de HER2 de aquéllos que expresan las formas truncadas.... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2, estando dicho epítopo definido por una secuencia incluida en SEQ ID NO: 2, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen -DSMZ” con el número de registro DSM ACC3016 o la línea celular de hibridoma depositada en la “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen -DSMZ” con el número de registro DSM ACC3017, y en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo puede discriminar entre la variante truncada CTF611 representada por SEQ ID NO: 1 y CTF-616 representada por SEQ ID NO: 7, de HER2.

2. Hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo según la reivindicación 1.

3. Método para producir un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo mediante la línea celular de

hibridoma según la reivindicación 2. 15

4. Método de diagnóstico de cáncer, que comprende la detección de la presencia de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 en una muestra de paciente, usando uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 1.

5. Método según la reivindicación 4, que es un método de pronóstico que permite el pronóstico de evolución de crecimiento tumoral y/o metástasis.

6. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo según la reivindicación 1, para el diagnóstico y la determinación del pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2. 25

7. Agente para el diagnóstico y la determinación del pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo según la reivindicación 1.

8. Agente para el diagnóstico según la reivindicación 7, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se dispone sobre un soporte sólido.

9. Kit para el diagnóstico y la determinación del pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas, en el que los medios de detección comprenden al 35 menos un agente según las reivindicaciones 7 u 8.

10. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, para uso terapéutico.

11. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres 40 en los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO: 1.

12. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 11 para su uso según la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres de mama en mamíferos, incluyendo seres humanos.

13. Anticuerpo o fragmento según una o más de las reivindicaciones 11 a 12, para su uso según las reivindicaciones 11 y 12, respectivamente, para su uso en el tratamiento o la prevención de cánceres seleccionados del grupo que comprende cáncer de pulmón, páncreas, colon, estómago, próstata, cabeza y cuello, piel, riñón, testículo, tiroides, vejiga urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula salival, laringe, peritoneo, región nasofaríngea, trompas de Falopio, tumores de Wilms, así como 50 linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma sinovial, meduloblastomas, tumores trofoblásticos, gliomas, glioblastomas, colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma, neurilemomas, neuromas, rabdomiosarcomas.

14. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, para la fabricación de un 55 medicamento para el tratamiento del cáncer.

15. Composición farmacéutica para el tratamiento de cánceres en la que al menos se expresa la forma truncada del receptor HER2 que contiene la SEQ ID NO: 1, caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según la reivindicación 1 y al menos un excipiente y/o vehículo 60 farmacéuticamente aceptable.