Anticuerpos contra toxinas de Clostridium difficile y usos de los mismos.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo,

que se une específicamente a la toxina B de Clostridium difficile (C. difficile) con una KD inferior a 10 x 10-10 M medida por resonancia de plasmones superficiales y neutraliza la toxina B de C. difficile, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende:

(a) una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 62, 64 y 66; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 68, 70 y 72.

Anticuerpos contra toxinas de Clostridium difficile y usos de los mismos Antecedentes de la invención

Clostridium difficile (C. difficile) es una bacteria gram-negativa que produce enfermedad gastrointestinal en seres humanos. C. difficile es la causa más común de diarrea infecciosa en pacientes hospitalizados y es una de las infecciones nosocomiales más comunes en conjunto (Kelly y col., New Eng. J. Med., 330:257-62, 1994). En realidad, la enfermedad asociada a este patógeno puede aquejar a hasta tres millones de pacientes hospitalizados al año en Estados Unidos (McFarland y col., New Eng. J. Med., 320:204-10, 1989; Johnson y col., Lancet, 336:97-100, 1990).

El tratamiento con antibióticos tales como ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas y clindamicina que altera la flora intestinal normal puede permitir la colonización del intestino con C. difficile y conduce a enfermedad por C. difficile (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med., 49:375-90, 1998). La aparición de enfermedad por C. difficile se produce normalmente cuatro a nueve días después de empezar el tratamiento con antibiótico, pero también puede producirse después de retirar la terapia con antibiótico. C. difficile puede producir síntomas que oscilan de diarrea y colitis leve a grave que incluye colitis pseudomembranosa (PMC), una forma grave de colitis caracterizada por dolor abdominal, diarrea líquida y enfermedad sistémica (por ejemplo, fiebre, náuseas). La enfermedad recurrente puede producirse en hasta el 20 % de los pacientes tratados de un primer episodio enfermedad, y aquellos que recayeron tienen un mayor riesgo de recaídas adicionales (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med., 49:375-90, 1998).

Se cree que la enfermedad por C. difficile es producida por las acciones de dos exotoxinas, la toxina A y la toxina B, sobre el epitelio intestinal. Ambas toxinas son proteínas de alto peso molecular (280-300 kDa) que catalizan la modificación covalente de proteínas Rho, proteínas pequeñas de unión a GTP que participan en la polimerización de actina, en células huésped. La modificación de proteínas Rho por las toxinas las inactiva, conduciendo a despolimerización de filamentos de actina y muerte celular. Ambas toxinas son mortales para ratones cuando se inyectan parenteralmente (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med., 49:375-90, 1998).

La enfermedad por C. difficile puede diagnosticarse por ensayos que detectan la presencia o actividad de toxina A o toxina B en muestras de heces, por ejemplo, inmunoensayos enzimáticos. Los ensayos de citotoxinas pueden usarse para detectar la actividad de la toxina. Para realizar un ensayo de citotoxina, las heces se filtran para eliminar bacterias y se determinan los efectos de toxinas citopáticas sobre las células cultivadas (Merz y col., J. Clin. Microbiol., 32:1142-47, 1994).

El tratamiento de C. difficile se complica por el hecho de que los antibióticos desencadenan enfermedad asociada a C. difficile. Sin embargo, los antibióticos son actualmente la opción de tratamiento primaria. Frecuentemente se usan antibióticos que es menos probable que produzcan enfermedad asociada a C. difficile tal como vancomicina y metronidazol. La resistencia a vancomicina que se desarrolla en otros microorganismos es un motivo de preocupación en el uso de este antibiótico para el tratamiento, ya que es el único tratamiento eficaz para infección por otros microorganismos (Gerding, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 250:127-39, 2000). También se usan enfoques probióticos en los que a un sujeto se le administran microorganismos no patógenos que supuestamente compiten por nichos con las bacterias patógenas. Por ejemplo, se ha informado del tratamiento con una combinación de vancomicina y Saccharomyces bouiardii (McFarland y col., JAMA., 271 (24):1913-8, 1994. Errata en: JAMA, 272(7) :518, 1994).

Se han desarrollado vacunas que protegen a los animales de la exposición mortal en modelos infecciosos de enfermedad (Torres y col., Infect. Immun. 63(12):4619-27,1995). Además, se ha mostrado que los anticuerpos policlonales protegen a los hámsteres de la enfermedad cuando se administran mediante inyección o la comida (Giannasca y col., Infect. Immun. 67(2):527-38, 1999; Kink y Williams, Infect. Immun., 66(5):2018-25, 1998). Se han aislado anticuerpos monoclonales murinos que se unen a toxinas de C. difficile y neutralizan sus actividades in vivo e in vitro (Corthler y col., Infect. Immun., 59(3):1192-5, 1991). Hay algunos informes de que los anticuerpos policlonales humanos que contienen anticuerpos neutralizantes de toxina pueden prevenir la recaída por C. difficile (Salcedo y col., Gut., 41 (3):366-70, 1997). La respuesta de anticuerpos contra la toxina A ha guardado relación con la evolución de la enfermedad, que indica la eficacia de respuestas humorales en el control de la infección. Los individuos con respuestas robustas de ELISA a la toxina A tuvieron enfermedad menos grave en comparación con individuos con bajos niveles de anticuerpo para la toxina A (Kyne y col., Lancet, 357(9251 ):189-93, 2001).

La función individual de la toxina A y la toxina B en la patogénesis de enfermedades y la función de anticuerpos antitoxina en la protección de enfermedad por C. difficile son controvertidas y pueden depender del huésped. En seres humanos, la respuesta de anticuerpos anti-toxina A ha guardado relación con la evolución de la enfermedad, sugiriendo un requisito para la respuesta de anti-toxina A para la protección. Esta observación es a diferencia de informes de organismos de C. difficile causantes de enfermedad que sólo expresan la toxina B, implicando que la toxina B puede contribuir a una enfermedad en seres humanos. Estas cepas negativas para toxina A también pueden producir enfermedad en hámsteres (Sambol y col., J. Infect. Dis., 183(12):1760-6, 2001).

Se sabe que el antisuero policlonal contra la toxina B de C. difficile inhibe el dominio catalítico de la toxina B (Genth y col., Inf. and Immun., 68(3): 1094-1101, 2000). Se sabe que anticuerpos de fragmento variable de la cadena sencilla recombinantes dirigidos contra la toxina B de C. difficile se unen al antígeno con alta afinidad (Deng y col., Clin. Diagn. Lab. Immun., 10(4): 587-595, 2003).

Resumen de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la administración de anticuerpos contra la toxina A de C. difficile a un sujeto puede proteger al sujeto de la recaída de enfermedad mediada por C. difficile in vivo. La administración de anticuerpos a una o ambas de la toxina A y la toxina B puede prevenir la enfermedad mediada por C. difficile primaria. Los anticuerpos de alta afinidad contra toxinas de C. difficile pueden producirse, por ejemplo, en ratones tales como ratones transgénicos que expresan segmentos del gen de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos pueden neutralizar la citotoxicidad de toxinas in vitro y neutralizar la enterotoxicidad de toxinas in vivo. Los anticuerpos que reconocen la toxina A y/o la toxina B pueden inhibir y proteger de la enfermedad in vivo.

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la toxina B de Clostridium difficile (C. difficile) con una Kd inferior a 10 x10'10 M medida por resonancia de plasmones superficiales y neutraliza la toxina B de C. difficile, en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende:

(a) una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID N2: 62, 64 y 66; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID N2: 68, 70 y 72.

Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos neutralizan la toxina B in vitro, inhiben la unión de toxina B a células de mamífero e/o inhiben enfermedad mediada por C. difficile in vivo.

En diversas realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos tienen una o más de las siguientes características: cuando se administran a un ratón, protegen al ratón de la administración de una toxina de C. difficile en una cantidad que sería mortal para un ratón de control al que no se le administra el anticuerpo; protegen de o inhiben colitis mediada por C. difficile, colitis asociada a antibióticos o colitis pseudomembranosa (PMC) en un sujeto; protegen de o inhiben diarrea en un sujeto; e/o inhiben la recaída de enfermedad mediada por C. difficile.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la invención, en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N2: 54 y la región variable de la cadena ligera comprende la... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la toxina B de Clostrídium difficile (C. difficile) con una Kd inferior a 10 x 10'10 M medida por resonancia de plasmones superficiales y neutraliza la toxina B de C. difficile, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende:

(a) una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID N2: 62, 64 y 66; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID N2: 68, 70 y 72.

2. El anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N2: 54 y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N2: 58.

3. El anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

(a) el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico; y/o

(b) la porción de unión a antígeno comprende Fab, F(ab')2, scFv o Fv.

4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Una composición terapéutica que comprende:

(a) el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b) un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la toxina A de C. difficile.

6. La composición de la reivindicación 5, en la que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la toxina A de C. difficile:

(a) compite para unirse a la toxina A con un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID N2: 1 y 4, SEC ID N2: 2 y 5 o SEC ID N2: 3 y 6, respectivamente; o

(b) se une específicamente a la toxina A con una Kd inferior a 20 x 10'6 M medida por resonancia de plasmones superficiales.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en la que:

(a) el anticuerpo que se une específicamente a la toxina A de C. difficile es un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico; y/o

(b) la porción de unión a antígeno del anticuerpo que se une específicamente a la toxina A de C. difficile comprende Fab, F(ab')2, scFv o Fv.

8. El anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 para su uso en un procedimiento para tratar el cuerpo humano o animal mediante terapia o en un procedimiento de diagnóstico llevado a cabo en el cuerpo humano o animal.

9. El anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 para su uso en un procedimiento para tratar enfermedad mediada por C. difficile en un sujeto, opcionalmente en el que:

(a) el sujeto es humano; y/o

(b) el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se administran intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente al sujeto.

10. El anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 9 en el que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se administra con otro agente terapéutico, opcionalmente en donde el agente terapéutico es:

(a) un antibiótico, gamma-globulina policlonal, agente probiótico o vacuna de C. difficile',

(b) vancomicina, metronidazol, bacitracina, Saccharomyces boulardii o una vacuna de toxoide de C. difficile', o

(c) un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a toxina A de C. difficile.

11. Un kit que comprende:

(a) el anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b)

(i) una marca;

(ii) un agente terapéutico;

(iii) un agente para acoplar el anticuerpo a una marca o agente terapéutico; o

(iv) un dispositivo para administrar el anticuerpo a un sujeto.

12. Un vector de expresión ácido nucleico que comprende:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende SEC ID N°:

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende SEC ID N°:

13. Una célula huésped aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12.

14. Una célula huésped aislada que comprende:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende SEC ID N°:

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende SEC ID N°:

54; y 58.

54; y 58.