Anticuerpos anti-TGF-beta humanizados.

Un anticuerpo humanizado que se enlaza a TGF-beta que comprende un dominio variable pesado (VH) que comprende residuos de una región hipervariable no humana incorporados en un dominio VH humano,

comprendiendo dicho dominio variable regiones marco (FR) de huIII como se muestra en la figura 1B (SEQ ID NO: 6) con sustitución en la posición 49 y posición 72, y adicionalmente en la posición 68, 48, 70, 74, o 79; en donde

a) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 68 la fenilalanina es cambiada a una alanina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina;

b) en la posición 48 la valina es cambiada a una isoleucina, en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina;

c) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 70 la isoleucina es cambiada a una leucina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina;

d) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina, y en la posición 74 la asparagina es cambiada a una lisina; o

e) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina, y en la posición 79 la leucina es cambiada a una alanina; y

a) que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VL huxTGFB como se muestra en la figura 1A (SEQ ID NO: 3); y

b) que comprende los residuos de región determinante de la complementareidad (CDR) del dominio VH GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 21); VNNPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 22); y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 23), o que comprende los residuos de la región determinante de la complementareidad (CDR) del domino VH GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 21); VINPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 43); y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 23); o que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VH en SEQ ID NO: 4.

Anticuerpos anti-TGF-beta humanizados Campo de la invención La presente invención se relaciona con anticuerpos anti-TGF-beta humanizados y métodos para preparar los mismos y uso de los mismos en métodos para tratar trastornos relacionados con TGF-beta, como se define en las reivindicaciones. Los anticuerpos son útiles, por ejemplo, en purificaciones por inmunoafinidad, inmunoensayos, imágenes in vivo, ensayos con radiorreceptores, y tratamientos en donde se desea antagonizar la actividad de TGFbeta, particularmente la actividad de TGF-beta1.

Antecedentes de la invención El factor de trasformación de crecimiento (TGF-beta) es una citoquina multifuncional citada originalmente por su capacidad para trasformar fibroblastos normales en células capaces de crecimiento independiente del anclaje. Las TGF-betas, producidas primariamente por células hematopoyéticas y tumorales pueden regular, esto es, estimular o inhibir, el crecimiento y diferenciación de células a partir de una variedad de orígenes tisulares tanto normales como neoplásticos (Spom et al., Science, 233: 532 (1986) ) y estimular la formación y elaboración de diversos elementos estromales. Para una revisión general de la TGF-beta y sus acciones véase Sporn et al., J.Cell Biol., 105: 1039-1045 (1987) y Sporn y Roberts, Nature, 332: 217-219 (1988) .

Se conoce que están involucradas en muchos procesos celulares proliferativos y no proliferativos tales como proliferación y diferenciación celular, desarrollo de embriones, formación de matrices extracelulares, desarrollo óseo, curación de heridas, hematopoyesis y respuestas inmunes e inflamatorias. Pircher et al, Biochem. Biophys. Res. Common., 136: 30-37 (1986) ; Wakefield et al., Growth Factors, 1: 203-218 (1989) ; Roberts y Sporn, pp 419-472 in Handbook of Experimental Pharmacology eds M.B. Sporn & A.B. Roberts (Springer, Heidelberg, 1990) ; Massague et al., Annual Rev. Cell Biol., 6: 597-646 (1990) ; Singer and Clark, New Eng. J. Med., 341: 738-745 (1999) . También la TGF-beta es utilizada en tratamiento y prevención de enfermedades en la mucosa intestinal. WO 2001/24813.

De interés particular desde un punto de vista inmunológico son las potentes actividades inmunosupresoras de TGFbeta, las cuales incluyen la muerte activada por linfoquina (LAK) e inhibición citotóxica de linfocitos T (CTL) (Ranges et al., J. Exp. Med., 166: 991 (1987) , Espevik et al., J. immunol., 140: 2312 (1988) , Grimm et al., Cancer Immunol. Immunother., 27: 53 (1988) , Kasid et al., J. Imnnmol., 141: 690 (1988) , Mule et al., Cancer Immunol. Immunother.,

26: 95 (1988) ) , linfopoyesis deprimida de células B y expresión de cadena liviana kappa (Lee et al., J. Exp. Med.,

166: 1290 (1987) ) , regulación negativa de hematopoyesis (Hino et al., Br. J. Haematol., 70: 143 (1988) , Sing et al., Blood, 72: 1504 (1988) ) , subregulación de la expresión de HLA-DR en células tumorales (Czamiecki et al., J. Immunol., 140: 4217 (1988) , Zuber et al., Eur. J. Immunol., 18: 1623 (1988) ) , e inhibición de la proliferación de linfocitos B activados por antígenos en respuesta al factor de crecimiento de células B (Petit-Koskas et al., Eur. J. Immunol., 18: 111 (1988) ) . La observación de que muchos tumores humanos (deMartin et al., EMBO J., 6: 3673 (1987) , Kuppner et al., Int. J. Cancer, 42: 562 (1988) ) y muchas líneas celulares tumorales (Der y nck et al., Cancer Res., 47: 707 (1987) , Roberts et al., Br. J. Cancer, 57:594 (1988) ) que producen TGF-beta sugiere un posible mecanismo para que estos tumores evadan la vigilancia inmunológica normal. Esta inmunomodulación negativa, acoplada con las observaciones de que ciertas líneas celulares transformadas han perdido la capacidad de responder a TGF-beta en una forma autocrina (Wakefield et al., J. Cell Biol., 105: 965 (1987) , McMahon et al., Cancer Res., 46: 4665 (1986) ) , y de que la TGF-beta estimula la formación de estromas, y disminuye la vigilancia inmune del tumor, sugiere modelos atractivos para la desregulación y proliferación del neoplasma (Roberts et al., Br.

J. Cancer, supra) .

Además, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5, 824, 297 y 5, 262, 319 divulgan un método para inhibir envenenamiento citotóxico de células normales administrándoles una TGF-beta tal como TGF-beta3.

Hay al menos cinco formas de TGF-beta identificadas actualmente, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, y TGF-beta5. Se conocen métodos adecuados para purificar esta familia de TGF-betas a partir de diversas especies tales como humanos, ratón, mono verde, cerdo, bovinos, pollos y ranas, y de diversas fuentes corporales tales como hueso, plaquetas, o placenta, para producirla en cultivos celulares recombinantes, y para determinar su actividad. Véase, por ejemplo, Der y nck et al., Nature, 316: 701-705 (1985) ; Publicación de Patente Europea Nos. 200, 341 publicada el 10 de diciembre de 1986, y 169, 016 publicada el 22 de enero de 1986, 268, 561 publicada el 25 de mayo de 1988, y 267, 463 publicada el 18 de mayo de 1988; Patente de los Estados Unidos No. 4, 774, 322; Cheifetz et al, Cell, 48: 409-415 (1987) ; Jakowlew et al., Molecular Endocrin., 2: 747-755 (1988) ; Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) , 85: 4715-4719 (1988) ; Der y nck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986) ; Sharples et al., ADN, 6:239-244 (1987) ; Der y nck et al., Nucl. Acids. Res., 15: 3188-3189 (1987) ; Der y nck et al., Nucl. Acids. Res.. 15: 3187 (1987) ; Der y nck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988) ) ; Seyedin et al., J. Biol. Chem., 261: 5693-5695 (1986) ; Madisen et al., ADN, 7: 1-8 (1988) ; y Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) , 85: 79-82 (1988) .

La forma activada de TGF-beta1 es un homodímero formado por la dimerización de los 112 aminoácidos de terminal carboxi de un precursor de 390 aminoácidos (Der y nck et al., Nature, supra) . La TGF-beta2 tiene una forma precursora de 414 aminoácidos y también es procesada a homodímero a partir de los 112 aminoácidos de terminal carboxi que comparten aproximadamente 70% de homología con la forma activa de la TGF-beta1 (Marquardt et al.,

J. Biol. Chem., 262: 12127 (1987) ) . La TGF-beta2 ha sido purificada a partir de plaquetas de porcinos (Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: 1946-1949 (1987) ) y células de glioblastoma humano (Wrann et al., EMBO J., 6:1633 (1987) ) , y la TGF-beta2 humana recombinante ha sido clonada (deMartin et al., supra) . La TGF-beta1 recombinante ha sido clonada (Der y nck et al., Nature, supra) y expresada en células de ovario de hámster chino (Gentr y et al., Mol. Cell. Biol., 7: 3418-3427 (1987) ) . Véase las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4, 774, 322; 4, 843, 063; y 4, 848, 063 con respecto a CIF-A y CIF-B, reconocidos ahora como TGF-beta1 y 2, respectivamente. Ellingsworth et al.,

J. Biol. Chem., 261: 12362-12367 (1986) . Aunque hay 14 diferencias en aminoácidos en los primeros 36 residuos de aminoácidos de las 2 formas (TGF-beta1 y TGF-beta2) sus actividades biológicas son similares. Cheifetz et al., Cell,

48: 409-415 (1987) ; Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: supra.

Las TGF-beta3, TGF-beta4 y TGF-beta5, las cuales son las formas más recientemente descubiertas de TGF-beta, fueron identificadas por selección de bibliotecas de ADNc. Ninguna de estas tres proteínas putativas ha sido aislada de fuentes naturales, aunque la inmunoprecipitación Northern demuestra la expresión de los correspondientes ARNm. La TGF-beta3 humana y porcina ha sido clonada y esta descrita como homodímeros y expresada en células de ovario de hámster chino (Der y nck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988) , ten Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4715 (1988) ; Patente de los Estados Unidos No. 4, 886, 747) . Véase también la WO 1992/00318 con respecto a las proteínas TGF-beta3 y anticuerpos para las mismas. La TGF-beta1 difiere de la TGF-beta2 por 27 cambios principalmente conservadores y de la TGF-beta3 por 22 cambios principalmente conservadores. Estas diferencias han sido relacionadas con la estructura 3D. Schlunegger y Grutter, Nature, 358: 430-434 (1992) .

Las TGF-beta4 y TGF-beta5 fueron clonadas a partir de una biblioteca de ADNc de condrocitos de pollo (Jakowlew et al., Molec. Endocrinol., 2: 1186-1195 (1988) ) y a partir de una biblioteca de ADNc de oocitos de rana, respectivamente. La biblioteca de ADNc de oocitos de rana puede ser seleccionada utilizando una sonda derivada de una o más secuencias de otro tipo de TGF-beta. El ARNm de TGF-beta4 es detectable en condrocitos de embrión de pollo, pero es bastante menos abundante que el ARNm de TGF-beta3 en embriones en desarrollo o en fibroblastos de embriones de pollo. El ARNm de TGF-beta5 es expresado en embriones de pollo más allá del estado de neurula y en células de renacuajo Xenopus (XTC)... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado que se enlaza a TGF-beta que comprende un dominio variable pesado (VH) que comprende residuos de una región hipervariable no humana incorporados en un dominio VH humano, comprendiendo dicho dominio variable regiones marco (FR) de huIII como se muestra en la figura 1B (SEQ ID NO: 6) con sustitución en la posición 49 y posición 72, y adicionalmente en la posición 68, 48, 70, 74, o 79; en donde a) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 68 la fenilalanina es cambiada a una alanina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina;

b) en la posición 48 la valina es cambiada a una isoleucina, en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina;

c) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 70 la isoleucina es cambiada a una leucina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina;

d) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina, y en la posición 74 la asparagina es cambiada a una lisina; o e) en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina, y en la posición 79 la leucina es cambiada a una alanina; y

a) que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VL huxTGFB como se muestra en la figura 1A (SEQ ID NO: 3) ; y

b) que comprende los residuos de región determinante de la complementareidad (CDR) del dominio VH GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 21) ; VNNPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 22) ; y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 23) , o que comprende los residuos de la región determinante de la complementareidad (CDR) del domino VH GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 21) ; VINPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 43) ; y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 23) ; o que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VH en SEQ ID NO: 4.

2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en donde en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 70 la isoleucina es cambiada a una leucina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina,

en donde una sustitución en FR adicional es en la posición 74 en SEQ ID NO: 6, especialmente en donde en la posición 74 la asparagina es cambiada a una lisina.

3. El anticuerpo humanizado en las reivindicaciones 1 o 2 a) que es un anticuerpo IgG1 intacto o un fragmento de anticuerpo, particularmente un fragmento Fab; y/o b) que no está conjugado con un agente citotóxico o que está conjugado con un agente citotóxico.

4. El anticuerpo humanizado en la reivindicación 1 en donde en la posición 49 la alanina es cambiada a una glicina, en la posición 68 la fenilalanina es cambiada a una alanina, y en la posición 72 la arginina es cambiada a una alanina, en donde el anticuerpo

(i) comprende adicionalmente una sustitución en la posición 51 en el FR de SEQ ID NO: 6, en donde la asparagina es cambiada a una isoleucina.

5. El anticuerpo humanizado de cualquiera de las reivindicaciones 1–4, en donde el anticuerpo se enlaza a una o más de las siguientes: TGF-beta1 y TGF-beta2.

6. Una composición que comprende el anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo.

7. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

8. Un vector o una célula anfitriona que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Un proceso para producir un anticuerpo humanizado que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 8 de tal manera que el ácido nucleico sea expresado y el anticuerpo sea producido, que comprende

opcionalmente de manera adicional la recuperación del anticuerpo del cultivo de la célula anfitriona preferiblemente del medio de cultivo de la célula anfitriona.

10. El proceso de la reivindicación 9 en donde, antes de cultivarla, la célula anfitriona es cotransfectada con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio pesado variable y con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio liviano variable.

11. El anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en un método para tratar un trastorno por TGF-beta en un mamífero, en donde se va a administrar una cantidad efectiva del anticuerpo humanizado al mamífero, y en donde el trastorno es fibrosis, una lesión arterial, una infección, artritis reumatoide, o cáncer, particularmente donde el cáncer es cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de ovarios o melanoma maligno.

12. El anticuerpo humanizado para uso en un método para tratar un trastorno por TGF-beta de la reivindicación 11,

a) en donde el mamífero es un primate;

b) en donde el mamífero es un humano; y/o c) en donde una cantidad efectiva de un agente terapéutico diferente al anticuerpo humanizado va a ser administrada adicionalmente al mamífero, particularmente en donde el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, citoquina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente antiangiogénico, o un anticuerpo, especialmente en donde el agente terapéutico es un agente antiangiogénico.

13. El anticuerpo humanizado para uso en un método para tratar un trastorno por TGF-beta de la reivindicación 12 c) ,

a) en donde el agente terapéutico es un anticuerpo, particularmente

(i) en donde el anticuerpo se enlaza a un factor de crecimiento endotelial vascular, o

(ii) en donde el anticuerpo se enlaza al antígeno Her-2;

b) en donde el anticuerpo es un anticuerpo intacto, o un fragmento de un anticuerpo, particularmente un fragmento Fab; y/o c) en donde el anticuerpo está conjugado con un agente citotóxico o no está conjugado con un agente citotóxico.

14. Uso del anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la manufactura de un medicamento para tratar un trastorno por TGF-beta en un mamífero, en donde una cantidad efectiva del medicamento va a ser administrada al mamífero, y en donde el trastorno es fibrosis, una lesión arterial, una infección, artritis reumatoide, o cáncer, particularmente en donde el cáncer es cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de ovarios, o melanoma maligno, particularmente en donde el anticuerpo puede ser como se define en la reivindicación 12 o 13.

15. El anticuerpo humanizado para uso en un método para tratar un trastorno por TGF-beta de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde el anticuerpo se enlaza a uno cualquiera o más de las siguientes: TGF-beta1 y TGF-beta2.

16. Un método para detectar una TGF-beta en una muestra corporal que comprende poner en contacto el anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 con la muestra corporal y determinar si ha ocurrido el enlazamiento del anticuerpo a la TGF-beta.

17. Un artículo de manufactura que comprende un contenedor que contiene el anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 e instrucciones que dirigen a un usuario para tratar un trastorno por TGF-beta en un mamífero con el anticuerpo en una cantidad efectiva, comprendiendo de manera adicional particularmente un contenedor que contiene un agente terapéutico diferente al anticuerpo humanizado, en donde las instrucciones dirigen al usuario para tratar el trastorno con el anticuerpo en combinación con el agente en cantidades efectivas, y/o particularmente en donde el mamífero es un humano.

18. Un anticuerpo de TGF-beta de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 y un anticuerpo que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular para uso en un método para tratar cáncer en un mamífero en donde una cantidad efectiva del anticuerpo de TGF-beta y un anticuerpo que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular se van a administrar al mamífero.

19. El anticuerpo de TGF-beta y un anticuerpo que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular para uso en un método para tratar cáncer de la reivindicación 18, a) en donde el mamífero es humano; b) en donde el anticuerpo de TGF-beta se enlaza a una o más de las siguientes: TGF-beta1 y TGF-beta2;

c) en donde el anticuerpo se enlaza a TGF-beta1; y/o d) en donde el anticuerpo se enlaza a TGF-beta 1 y TGF-beta2.

20. Uso de un anticuerpo de TGF-beta de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 y un anticuerpo que se enlaza a un factor de crecimiento endotelial vascular para la manufactura de un medicamento para tratar cáncer en un mamífero, en donde una cantidad efectiva del medicamento va a ser administrada al mamífero, particularmente en donde el

anticuerpo puede ser definido como en la reivindicación 19.